Розділ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1 Об'єкти та умови досліджень
Дослідження проводились на кафедрі генетики і фізіології рослин Ужгородського національного університету, відділах фізіології водного режиму рослин й радіобіології Інституту фізіології рослин і генетики НАН України в лабораторних та вегетаційних умовах.
Об'єктами досліджень обрано сорти озимої м'якої пшениці (Triticum aestivum L.) різних екотипів: Миронівська 61 (середньопосухостійкий), Білоцерківська 177, Поліська 90, Калінінська 27 (слабопосухостійкі), Одеська 16, Одеська 66 (посухостійкі).
В модельних лабораторних і вегетаційних дослідах вивчали вплив різного водозабезпечення у критичні до нестачі вологи періоди онтогенезу пшениці (фази сходів, колосіння і цвітіння) на перерозподіл 14СО2 в продуктах фотосинтезу (амінокислотах, органічних кислотах, цукрах, фосфорильованих та полімерних сполуках), метаболізм 14С-гліцину і 14С-глутамату, включення 32Р в органічні фосфати, кінетику поглинання міченого за тритієм амонійного азоту та вклад поглинутого амонійного і реутилізованого азоту у формування білкового комплексу зернівок сортів озимої пшениці.
2.2. Методи дослідження включення 14СО2 в продукти фотосинтезу (фосфорильовані і полімерні сполуки, амінокислоти, цукри, органічні кислоти) в листках сортів озимої пшениці
Перерозподіл 14С у продуктах фотосинтезу у листках сортів озимої пшениці вивчали в умовах вегетаційного досліду у грунтовій культурі. Рослини вирощували в посудинах Вагнера місткістю 8 кг за оптимальної вологості грунту - 60% (ПВ). У критичний до нестачі вологи період - фазу колосіння частину рослин не поливали, поступово доводячи водний дефіцит у листках до 30-33%. Контрольні рослини вирощували за оптимального зволоження грунту (60% від ПВ).
При введені мітки прапорцеві листки дослідних і контрольних рослин протягом 5 хв. витримували у спеціальній камері з 14СО2, який одержували шляхом додавання Na214CO3 у розчин концентрованої H2SO4. Після цього листки пшениці фотосинтезували у звичайній атмосфері. Через 30 і 60 хв. листки фіксували у рідкому азоті. Фіксований матеріал ліофілізували і розділяли на клітинні фракції: судини (рис. 2.2.1), цитоплазму (рис. 2.2.2) і хлоропласти (рис. 2.2.3) у безводних середовищах [288, 289].
Рис. 2.2.1. Фракція судин, виділена з листків пшениці
Рис. 2.2.2. Фракція цитоплазми, виділена з листків пшениці
Рис. 2.2.3. Хлоропласти, виділені з листків пшениці
З отриманих фракцій 80 %-ним кип'ячим етанолом екстрагували мічені по 14С спиртоводорозчинні речовини, з яких на колонках з іонообмінними смолами виділяли амінокислоти, органічні кислоти і цукри. Амінокислоти від інших метаболітів відділяли на колонках з іон-обмінною смолою марки Дауекс-50, приготовленій у водневій формі (катіоніт). Для цього смолу спочатку промивали 5% розчином HCl, а після дистильованою водою до повного зникнення реакції на Cl, що контролювали з допомогою AgNO3. Адсорбовані смолою амінокислоти вилучали 5 % розчином NH4OH (примінення NH4OH дає ту перевагу над загальноприйнятою методикою з застосуванням HCl, що у такому випадку залишки амінокислот не містять домішків кислоти, яка при хроматографуванні може пошкоджувати хроматографічний папір). Отриманий розчин випаровували на водяній бані до сухого залишку, який розчиняли у воді. Водний розчин амінокислот застосовували для визначення радіоактивності із тонкого шару на торцевому лічильнику БФЛ-2 або сцинтиляційному Бета-2 (Україна) чи LKB-1211 Rackbeta (Швеція).
З розчину, що пройшов через катіоніт (після виділення амінокислот) вилучали органічні кислоти з допомогою іон-обмінної смоли марки Дауекс-1, приготовленої у хлористій формі (аніоніт). При пропусканні водного розчину, що містить органічні кислоти і цукри через аніоніт на смолі спочатку осідають аніони хлору, а пізніше органічні кислоти.
У розчині, що пройшов через катіоніт й аніоніт визначали цукри, оскільки вони не адсорбуються на жодній зі смол. Для цього розчин випаровували у фарфоровій чашці на водяній бані до утворення плівки, яку розчиняли у дистильованій воді. В подальшому водний розчин цукрів використовували для визначення їх радіоактивності з тонкого шару на торцевому лічильнику БФЛ-2 або сцинтиляційному Бета-2 (Україна) чи LKB-1211 Rackbeta (Швеція).
Фосфорильовані сполуки виділяли з аніоніту, радіоактивність яких також визначали із тонкого шару на торцевому лічильнику БФЛ-2 або сцинтиляційному Бета-2 (Україна) чи LKB-1211 Rackbeta (Швеція). Радіоактивність спиртоводонерозчинних речовин (білки, пектини, клітковина) визначали на торцевому лічильнику БФЛ-2 із товстого шару.
2.3. Методи дослідження метаболізму 14С-гліцину та 14С-глутамату в рослинах пшениці
Метаболізм міченого по 14С-гліцину за різного водозабезпечення досліджували у коренях та листках рослин озимої пшениці сорту Миронівська 61, яку вирощували в лабораторних умовах у піщаній культурі при температурі 18-20 0С і природному освітленні. У 14-добовому віці в рослини імпульсно (протягом 30 хв.) вводили мічений по 14С гліцин (CH2NH2COOH). Фіксацію коренів і листків пшениці проводили у 80 % кип'ячому етанолі. Амінокислоти від інших сполук відділяли на колонках з іон-обмінними смолами марки Дауекс-50. Ідентифікацію окремих амінокислот проводили методами паперової хроматографії [290, 291]. При хроматографуванні застосовували "амінокислоти-свідки", з допомогою яких знаходили розташування на хроматографічному папері певних амінокислот. При розділенні амінокислот використовували нисхідну хроматографію із застосуванням розчину Партріджа (бутанол - оцтова кислота - вода у співвідношенні 4:1:5). (При цьому розділення амінокислот відбувалося у потоці хроматографічного розчину - зверху вниз).
Хроматограми проявляли розчином нінгідрину в ацетоні, на відміну від традиційної методики [290], при якій використовується розчин нінгідрину в ізатині. Така модифікація дає можливість ідентифікувати незначні кількості амінокислот, оскільки ацетон швидко випаровується, що запобігає їх втра