РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Умови проведення та загальні схеми закладення дослідів
Основними об'єктами досліджень були паростки кукурудзи (Zea mays L.) найбільш розповсюдженого на території Криму сорту Одеська 10 та гібридів одеської селекції - ОдМа 310 МВ, Од 408 МВ, Фоліант МВ. Насіння для дослідів було одержане в Селекційно-генетичному інституті - Національному центрі насінництва та сортовивчення УААН (м. Одеса).
Препарат продуктів термофільного метанового бродіння (ПТМБ) мелясної барди виробництва Андрушевського спиртозаводу був наданий відділом фізіології росту та розвитку ІФРГ НАН України. Препарат івін (N-оксид 2,6-диметилпірідину) - Інститутом біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. Нами було використано також синтетичний цитокінін - 6-бензиламінопурин (6-БАП) виробництва фірми "Merck".
У першій серії експериментів насіння пророщували в темряві, при температурі 26?1?С, в чашках Петрі або в кюветах на зволоженому фільтрувальному папері. Розчини препаратів 6-БАП, ПТМБ та івін готувались на воді (безсольовий фон) або на 0,1 н розчині NaCl (сольовий фон). Контроль - вода, а на сольовому фоні додатково порівнювали з чистим 0,1 н NaCl. Фізіологічно активні речовини в цих дослідах використовували в таких концентраціях: цитокінін (6-БАП) - 1-10 мкг/л, івін - 2-20 мг/л, ПТМБ - 25-100 мг/л. Через три доби у паростків вимірювали довжину осьових органів, сиру та суху масу коренів і пагонів.
В іншій серії дослідів рослини пророщували лабораторно-вегетаційним методом. Ґрунт у контрольному варіанті - луговий чорнозем без ознак засолення. В ґрунтовій культурі рослини вирощували в горщечках ємністю 0,5 кг, при вологості ґрунту 70-75% від ППВ. Відносна вологість повітря становила 55-60%, освітленість - 10 КЛК.
Ця серія дослідів включала два варіанти обробки рослин. Перший - дослідження впливу обприскування препаратами на початкові етапи розвитку паростків кукурудзи в умовах засоленої ґрунтової культури. Контрольні рослини пророщували на незасоленому ґрунті. У дослідних варіантах ґрунт засолювали внесенням з поливною водою хлориду натрію в концентрації 0, 2 % за хлором. Через два тижні при досягненні рослинами фази двох справжніх листків їх обприскували водою (контроль та варіант з "чистим" засоленням) та водним розчинами 6-БАП, ПТМБ або івіну. Фізіологічно активні речовини використовували в таких концентраціях: цитокінін (6-БАП) - 5-20 мкг/л, івін - 2-20 мг/л, ПТМБ - 100-500 мг/л. Через три доби проводили повторну обробку. На четверту добу після другого обприскування рослин вимірювали довжину, сиру та суху масу коренів і пагонів. Тривалість досліду становила 21 добу.
Інший метод обробки полягав у попередньому замочуванні насіння в воді (контроль та варіант з "чистим засоленням") або розчинах регуляторів росту: цитокінін (6-БАП) - 5-10 мкг/л, івін - 5-20 мг/л, ПТМБ - 100-250 мг/л з подальшим висушуванням та висіванням на безсолевому фоні (контроль) та на засоленому фоні (концентрації 0,2% за хлором, варіант "чистого засолення" та варіанти з БАР). При досягненні рослинами тритижневого віку у рослин вимірювали довжину, сиру та суху масу коренів і пагонів і проводили аналіз.
2.2. Методики досліджень
Визначення ацидофікуючої активності коренів
Визначення ацидофікуючої активності коренів проводили за методом Н.Н. Єгорової, Л.Н. Воробьйова [44]. Корені паростків кукурудзи поміщали в інкубаційний розчин (0,1 мМ CaSO4 + 1 мМ KCl) і протягом 1,5 годин з інтервалом в 10 хвилин реєстрували зміни рН за допомогою іономіра ЭВ-74 і розраховували кількість виділених протонів. Формула, наведена в роботі Д.Б.Вахмістрова, О Ен До [23], була нами модифікована у наведену нижче, згідно з якою ми розраховували швидкість виділення протонів коренями:
, де
- швидкість виділення протонів коренями, моль/г коренів?хвилину;
та - концентрація протонів в інкубаційному розчині до розташування в ньому коренів та через t хвилин відповідно, моль;
M - сира маса коренів паростків (г), яка припадає на 1 літр інкубаційного розчину;
t - відповідний вимірюванню час інкубації, хвилини.
В роботі наведені показники середньої швидкості виділення протонів коренями різних гібридів та сорту кукурудзи.
Дослідження впливу засолення та фітогормонів на активність Н+-АТФази коренів
Дослідження впливу засолення та фітогормонів на активність Н+-АТФази коренів проводили за модифікованою методикою В.В.Полевого та О.В.Танкелюн [126]. Наважку 0,5 г коренів розтирали у ступці на холоді з додаванням 4 мл холодного середовища для виділення. Середовище виділення містило: 0,05 трис-HCl (рН 7,6), 0,5 М сахарози, 0,005 М ЕДТА, 0,01 М меркаптоетанолу. Гомогенат центрифугували на холоді при 12 тис.об./хвилину 15 хвилин. Супернатант наслоювали на градіент густини сахарози, що мав шість шарів ( 25, 30, 34, 38 і 48% розчини, які готували на трис-HCl буфері з рН 7,2). Друге центрифугування вели на холоді при 18 тис.об.?хвилину протягом години. Після центрифугування медичним шприцом відбирали фракції 34-38%, збагачені мікровезикулами плазмалеми, котрі і використовували для визначення активності ферменту Н+-АТФази.
Середовище інкубації складало: 0,03 М трис-HCl буфер (рН 6,0), 50 мМ KCl, 40 мМ NaCl, 3 мМоль MgSO4 та 3 мМоль АТФ. У пробірки додавали 1 мл екстракту ферменту та 2 мл середовища інкубації. В контрольні додавали 2 мл 10% трихлороцтової кислоти - ТХО. Інкубацію проводили протягом години при температурі 37?С. Після закінчення терміну в дослідні пробірки доливали по 2 мл 10% ТХО для закінчення роботи ферменту. Далі вимірювали кількість відщепленого АТФазою фосфору за годину у модифікації В.П. Скулачова [104].
В сухі та чисті пробірки наливали по 2 мл дослідного розчину після інкубації, 2 мл 1 М CH3COONa, 4 мл ацетатного буферу з рН=4,0 та 1 мл 1% розчину аскорбінової кислоти в 0,001 М CuSO4. Залишали суміш після ретельного перемішування на 10 хвилин. Наприкінці додавали 1 мл 1% молібдату амонію на 0,05 н H2SO4. Залишали суміш на 10 хвилин. Ко