РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи досліджень
Об'єктом наших досліджень, первинним культиваційним матеріалом, було насіння 12 видів роду Gentiana L., отримане за обміном з ботанічних садів Європи і США протягом 1998 року. У ході роботи було визначено походження зразків насіння, природне поширення досліджуваних видів, їх екологічний статус [60-62, 103, 147, 150, 161, 166, 167, 200, 212, 219]. Одержані рослини увійшли до складу колекції Ботанічного саду ім. акад. О.В. Фоміна (табл. 2.1.). Серед тирличів, що стали об'єктом наших досліджень, є п'ять рідкісних видів. Батьківщина одного з них - G. andrewsii Griseb. - південно-східна частина Північної Америки [144, 157]. Два інших види, які знаходяться під охороною - G. alba Muhl. і G. saponaria L. - зустрічаються як у Північній Америці [144, 147, 173, 181, 217], так і на територіях Східної Азії [161, 215]. Далекосхідний вид G. dahurica Fish. має статус рідкісного на території Монголії [57, 171]. Хоч ареал G. cruciata L. охоплює Європу, Малу та північ Середньої Азії, Західний Сибір [15, 108, 113, 212], цей вид також вважається рідкісним у декількох країнах [60, 89, 159, 170].
Решта досліджуваних представників роду Gentiana L. є цінними лікарськими рослинами, що, можливо, можуть бути використані як замінники G. lutea L. та інших тирличів, яким загрожує зникнення [69, 103].
До колекції тирличів Ботанічного саду ім. акад. О.В. Фоміна досліджувані види було включено після висадження їх у незахищений ґрунт на ділянки саду у 2003 році (табл.2.1.).
Таблиця 2.1.
Характеристика досліджуваних видів Gentiana L., що увійшли до колекції Ботанічного саду ім. акад. О.В. Фоміна (Київ, 2003)
ТаксонПоходження насінняПриродне поширення і
екологічний статусG. alba Muhl.JenaСхід. Азія, Схід Півн. Амер.; рідкісний у деяких штатах США (Вісконсін, Індіана), Канади (Онтаріо)
Продовж. табл. 2.1.
G. andrewsii Griseb.ChicagoСхід Півн. Амер.; рідкісний у деяких штатах США (Іллінойс, Огайо) і Канади (Онтаріо)G. bigelovii A. GrayJenaЦентр. і східні р-ни Півн. Амер., від Півд.-Схід. Вайомінгу до АрізониG. cachemirica DecnePotsdamСхідна АзіяG. crassicaulis DuthieGiessenСхідна АзіяG. cruciata L. GiessenЗахід. Азія, Далекий Схід, Європа; рідкісний в Захід. Європі, деяких областях Росії, в БілорусіG. dahurica Fish.NantesСхідна Азія;
рідкісний у МонголіїG. decumbens L.TartuСхідна Європа, Центр. і Захід. АзіяG. macrophylla Pall.InnsbruckСхідна Азія, Далекий СхідG. rockhillii Hemsl.PotsdamПередгірні райони Схід. АзіїG. saponaria L.GiessenСхід. Азія, Схід Півн. Амер.; рідкісний у деяких штатах США (Теннессі, Вірджинія)G. tibetica King. ex HookJenaСхід. Азія, Тибет, Гімалаї Біометричні показники насіння тирличів визначали за методичними вказівками з насінництва інтродуцентів [79]. Масу 1000 насінин визначали за допомогою аналітичних вагів. Для визначення розмірів насіння користувались бінокулярним мікроскопом МБС-10.
Насіння пророщували за методикою М.Г. Ніколаєвої і співр. [86] та за власними їх модифікаціями [20]: для виведення насіння із стану спокою і визначення оптимального способу передпосівної обробки, його піддавали холодовій стратифікації протягом 30-90 діб або витримували у розчині 100 мг/л ГК3 протягом доби, після чого поміщали у септичні або асептичні умови.
Лабораторну схожість і енергію проростання визначали за П.П. Вавіловим [102].
Для дослідження проростання у стерильних умовах насіння стерилізували поверхнево за власною, розробленою дослідним шляхом, модифікацією загальноприйнятих методик [49, 50, 80, 84]:
- запаювали по 50 насінин у торбинки з синтетичної тканини;
- на 1 хвилину поміщали їх у 70% етиловий спирт для кращого змочування поверхні насіння та первинної його стерилізації;
- переносили торбинку з насінням у 0,1% діацид, що є розчином 666,5 мг М-цитилперидинхлориду і 333,5 мг етилмеркурхлориду у 1 л води, на 15 хвилин;
- тричі промивали стерильною дистильованою водою.
Така послідовність операцій при стерилізації та термін обробки насіння стерилізуючими розчинами забезпечувала стерильність посівного матеріалу при мінімальній токсичній дії детергентів (етанол, діацид).
Після стерилізації насіння вилучали з торбинок і висівали на поверхню поживного агаризованого (0,7% агар-агар) середовища за Мурасіге і Скугом (МС) [201? з розведеним удвічі вмістом мінеральних солей (МС/2), 2% сахарози, рН 5,6-5,8. Макро- і мікроелементи поживного середовища використовували в половинних концентраціях, керуючись опублікованими даними різних авторів, роботи яких були присвячені культурі видів роду Gentiana L. in vitro [76, 115-117, 198] (табл.2.2.)
Таблиця 2.2.
Склад поживних середовищ МС і МС/2 для пророщування насіння і культури тирличів in vitro
КомпонентиСередовище МС, мг/лСередовище МС/2, мг/лNH4NO31650825KNO31900950CaCl2·2H2O440220MgSO4·7H2O370185KH2PO417085FeSO4·7H2O27,813,9 Продовж. табл. 2.2.
Na2EDTA·2H2O37,318,65H3BO36,23,1ZnSO4·7H2O8,64,3CuSO4·5H2O0,0250,0125CoCl2·6H2O0,0250,0125KI0,830,415Na2MoO4·2H2O0,250,125MnSO4·4H2O22,311,15Мезоінозит100100Тіамін-HCl0,10,1Піридоксин-HCl0,50,5Нікотинова к-та0,50,5 Висіяне насіння поміщали в темряву (у термостат) і на світло - на стелаж у культиваційній лабораторії. Культивували при освітленні 500 лк, 16-годинному фотоперіоді і температурі 20-22?С [49, 86].
Контрольним дослідом було пророщування насіння при температурі 20-22?С на світлі й у темряві. Його проводили паралельно в нестерильних умовах та in vitro. Субстратом для пророщування насіння тирличів у першому випадку був тричі промитий у дистильованій воді дрібнозернистий перліт, який у зволоженому стані поміщали у чашки Петрі. На його поверхню висівали насіння і накривали скляними кришками, поміщали в термостат і витримували в темряві. Таку ж кількість зразків виставляли на денне світло - в оранжерею.
Для асептичного пророщування насіння, мікроклонального розмноження