РОЗДІЛ 2
Об’єкти та методи досліджень
Експериментальна частина роботи виконана протягом 2000 – 2005 р.р. у відділі
фітогормонології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України.
2.1. Об’єкти дослідження
Об’єктами досліджень були два види прісноводних гетеротрихальних зелених
водоростей-макрофітів Chara contraria A. Brаun ex Kьtz. та Chara vulgaris L.,
які відносяться до роду Chara, родини Characeae, порядку Charales, класу
Charophyceae, відділу Charophyta [11, 18]. Харові водорості мешканці прісних
водойм, які, розростаючись, утворюють густі зарості. Досліджувані види широко
поширенні у непроточних, великих і дрібних водоймах України різного типу:
озерах, ставках, канавах ямах [5, 54]. Харові водорості морфологічно схожі до
деяких вищих рослин, наприклад, видів роголисника (Ceratophyllum) і водяного
хвоща (Equisetum).
Водорості для дослідження збирали у лісовому озері Шапарня (Конча-Заспа,
Київська область, заказник “Лісники”) та у висихаючому озері на території
експоцентру (м. Київ).
Ch. contraria та Ch. vulgaris однодомні водорості, помірно кущисті, дуже
інкрустовані вапном. Пагін харофітів складається із послідовно розташованих
клітин (міжвузлів) і вузлів з кільцями т.з. листків (тут і ділі назви умовні).
Схема будови талому харофітів представлена на рис. 2.1. Нумерацію частин талому
харофітів проводили від ризоїдів. У Ch. contraria досліджували: стерильний
(статево не зрілий) і фертильний (статево зрілий) цілі таломи; ооспори; ризоїди
з бульбочками; IІ, ІV, VІ та VIII від ризоїдів міжвузля різного розміру та віку
(без листків), відібрані на головній осі пагона фертильного талому та їх
складові – окремо протопласт з органелами (далі протопласт), клітинну оболонку
міжвузля з коровими клітинами (далі оболонка) та вузли обох кінців кожної
відпрепарованої клітини (далі вузли); кільця (мутовки) з листків з антеридіями
I-III нижніх (від ризоїдів) стеблових вузлів; листки з заплідненими оогоніями
IV-VI середніх вузлів і листки з об’єднаними гаметангіями верхньої частини
пагона VIII-XI cтеблових вузлів (рис. 2.2-2.5).
Стерильний талом Фертильний талом
Апікальна клітина
X 9
IX 8
VIII 7
М VII 6
І Л
Ж VI 5 И
В С
У V 4 Т
З К
Л IV 3 И
Я 2
III
II 1
I
Ризоїди
Рис. 2.1. Будова таломуChara contraria.
Рис. 2.3. Кільця нижніх зрілих листків з антеридіями (а) Chara contraria.
Рис. 2.4. Ризоїди (1) та бульбочки (2) Chara contraria.
Рис. 2.5. Відпрепаровані цілі міжвузля з вузлами (в) із верхньої (1), середньої
(2,3) та нижньої (4) частин головного пагона фертильного талому Chara
contraria.
У Ch vulgaris – цілий фертильний талом, кільця з листків I-III нижніх (від
ризоїдів) стеблових вузлів та листки з об’єднаними гаметангіями трьох верхніх
вузлів апікальної частини головного пагона.
Рослинний матеріал фіксували і зберігали при температурі -20єС до аналізу.
Ріст і розвиток листків, міжвузлів і репродуктивних органів характеризували за
морфологічними і ростовими показниками (довжина, ширина і діаметр) та визначали
масу їх сирої і сухої речовини.
2.2. Методи дослідження фітогормонів
З великого арсеналу фізико-хімічних методів визначення фітогормонів найбільше
використовуються: газорідинна-хроматографія (ГРХ), іноді в комбінації з
мас-спектрометрією (ГХ-МС), високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ),
імуноферментний аналіз (ІФА) та радіоімуний аналіз (РІА). Для визначення
ендогенних фітогормонів та їх біологічної активності застосовують специфічні
біотести. Виділення та аналіз ауксинів, гіберелінів, ЦТК та АБК в одній
рослинній пробі проводили за схемою, яка наведена на рис. 2.6. Визначення
фітогормонів у водоростях проводили методами, які прийняті для вищих рослин
[42].
Реактиви
У роботі використовували:
– індоліл-3-оцтову кислоту, зеатин, ізопентеніладенін, ізопентеніладенозин,
абсцизову кислоту фірми “Sigma” (США), зеатинрибозид фірми “Serva” (ФРН),
гіберелову кислоту фірми “Fluka” (Швейцарія);
– решта реактивів вітчизняного виробництва “Реахім” марок “хч” та “осч”;
– пластинки для тонкошарової хроматографії Silufol UV-254 (“Kavalier”, Чехія);
– Polyclar AT фірми “Sigma” (США);
– універсальний індикаторний папір рН 0-12 “Lachema” (Чехія);
– плоскодонні полістиролові планшети (Медполімер, Санкт-Петербург).
Екстракція 80% етанолом
Концентрування до водного залишку
Виморожування та центрифугування
фракціонування
аліквота аліквота аліквота
водного залишку водного залишку водного залишку
Екстракція Екстракція гіберелінів Екстракція ЦТК
ІОК та АБК діетиловим етилацетатом н-бутанолом н-бутанолом
ефіром при рН 2,5-3,0 вільні форми зв’язані форми при рН 8,0
вільні форми при рН 2,5-3,0
Лужний гідроліз водного залишку Очищення методом
1н NaOH в 30%-ному етанолі іонообмінної хроматографії на
колонці DOWEX 50Wx8
зв’язані форми ІОК та АБК
Далі аналогічно визначенню вільних форм
концентрування концентрування концентрування
до сухого залишку до сухого залишку до сухого залишку
тШХ ТШХ ТШХ
ВЕРХ Біотест ВЕРХ
ІОК
АБК Гібереліни ЦТК
Рис. 2.6. Схема визначення фітогормонів у водоростях.
Обладнання
Одночашкові терези “Sartorius” (точність 1х10-3, ФРН).
Торсійні терези ВТ (Польща).
Вакуумний ротаційний випаровувач типу 350 р (Польща).
Центрифуга К-24 фірми “Janetski” (НДР).
Хро