РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Матеріалом для вивчення ліпідного профілю крові та водно-ліпідної мантії шкіри були спостереження за 120 хворими із різними клінічними формами себорейного дерматиту та групи контролю, яка складалась з 20 практично здорових осіб віком від 16 до 45 років. Для вирішення дисертаційних завдань в період з 2003-2006р нами були проведені клінічні, біохімічні, мікробіологічні та загально клінічні дослідження. Спостереження проводились в період 2003-2006 рр. на базі кафедри дерматовенерології Національної медичної академії післядипломної освіти - у Київській міській шкірно-венерологічній лікарні і ШВД №4 .
Клінічне обстеження хворих на себорейний дерматит передбачало збір скарг, анамнестичних даних, з'ясування часу розвитку дерматозу, його перебігу, сезонності, характеру попередньої терапії та її ефективності. Під час збору анамнезу у хворих на себорейний дерматит з'ясовувалась наявність супутньої патології з боку шлунково кишкового тракту та нервової системи. Особлива увага приділялась вивченню клінічної картини захворювання: характеру висипів, частоти загострень, сезонності, часу виникнення та тривалості захворювання, наявності ускладнень, розповсюдженості. Одночасно проводилось лабораторне обстеження: загальні аналізи крові та сечі, цукор крові, при необхідності - консультації гастроентеролога, невролога та ендокринолога.
Дослідження ліпідного комплексу крові та водно-ліпідної мантії шкіри були проведені в лабораторії газорідинної хроматографії НДЛЦ НМУ імені О.О.Богомольця. Визначення вищих ЖК у досліджуваних біологічних об'єктах проводили за допомогою сучасного методу газорідинної хроматографії, на хроматографі серії "Цвет-500" із полум'яно-іонізуючим детектором в ізотермічному режимі при наступних умовах: використання скляної колонки (розміри 2,0?0,3см), заповненої фазою 5% поліетиленгліколь сукцинату (ПЕГС) на хромотоні N-АW-НМDS (зернування 0,125-0,160 мм), температура колонки - 190?С, температура випарювача - 250?С, затрати азоту та водню - 35 мл/хв., затрати повітря - 200 мл/хв., швидкість діаграмної стрічки - 240 мм/год., чутливість шкали підсилювача - 10-7А, об'єм проби, що вводиться - 3,0-5,0 мкл, тривалість аналізу - 20-25 хвилин.
Спосіб здійснювався таким чином: у хворих до початку лікування натщесерце із кубітальної вени брали кров в кількості 5 мл, виділяли сироватку. Сироватку в кількості 0,5-1,0 мл переносили в пробірку з притертою пробкою ємністю 10 мл, додавали 5-7 мл. хлороформ-метанольної суміші (у співвідношенні 2:1) і тримали 30 хвилин у холодильнику. Для кращого розділення фаз додавали 1мл. дистильованої води. Для аналізу відбирали хлороформну нижню фракцію, яка містить ліпіди. Визначення жирнокислотного спектру ліпідів крові (плазма та еритроцити) проводилося за методиками, запропонованими Т.С. Брюзгіною та інш. ?20? та ?6,7,42?, принцип яких полягає в екстракції ліпідів із плазми крові, еритроцитів, подальшому гідролізі та метилюванні ліпідних компонентів і газохроматографічному аналізі спектру ЖК ліпідів крові.
В жирнокислотному спектрі ліпідів ідентифікували найбільш інформативні ЖК: насичені, такі як С14:0 - мірістинова, С15:0 - пентадеканова, С16:0 - пальмітинова, С18:0 - стеаринова; мононенасичені, такі як С15:1 - пентадекаленова, С16:1 - пальмітоолеїнова, С18:1 - олеїнова; поліненасичені, такі як С18:2 - лінолева, С18:3-ліноленова, С20:3 - ейкозатрієнова, С20:4 - арахідонова, С22:6. - докозагексаєнова ЖК. )
Змиви з поверхні ураженої шкіри збирали вранці, натще за допомогою фільтрувального паперу площею 5,0?5,0 см. Фільтри паперові, змочені 10-15% розчином етилового спирту, накладали на обличчя (чоло, щоки) витримували упродовж 30 хв., обережно зволожували при висиханні. Фільтрувальний папір, просочений секретом шкіри, вміщували у пробирку із притертим корком об`ємом 15 мл. Загальні ліпіди секрету шкіри екстрагували 10 мл. хлороформ-метанольної суміші (у співвідношенні 2:1) на протязі 30 хвилин у холодильнику. Потім видаляли фільтрувальний папір, і для кращого розділення фаз додавали 1мл. дистильованої води. Для аналізу відбирали хлороформну нижню фазу, яка містить ліпіди. Хлороформні екстракти як із сироватки так із змивів шкіри випарювали досуху в потоці азоту при температурі 45? на водяній бані.Сухий осад ліпідів з'єднували з 5 мл розчину 1% сірчаної кислоти (Н2SO4) у метанолі і вміщували в ампули, які запаювали.
Потім проводили гідроліз і метилірування в термостаті при температурі 85? напротязі 20 хвилин. Екстракцію метиліруваних ЖК проводили двічі гексан-ефірною сумішю (співвідношення 1:1) в кількості 5 мл. Об'єднані екстракти випарювали в потоці азоту при 40С на водяній бані і сухий осад розчиняли в 40,0-50,0 мкл чистого гексану і вводили у випарювач хроматографа в кількості 5 мкл.
Потім проводили газорідинний аналіз жирнокислотного складу ліпідів на газовому хроматографі "Цвет-500" в ізотермічному режимі з полум`я-іонізаційним детектором при наступних умовах: для визначення спектру жирних кислот ліпідів використовували скляну колонку (розміром 2м х 0,3см), яка заповнена фазою 5% ПЕГС на хроматоні N-AW-HMDS (зерніння 0,125-0,160 мм.), температура колонки 1800С, температура випаровувача 2400С, розходження азоту і водню 35 мл/хв, повітря-200мл/хв., швидкість діаграмної стрічки 240 мм/год, чутливість шкали 10-7А, об`єм проби, що вводиться, 3-5 мкл, тривалість аналізу-20 хвилин.
Піки ЖК ідентифікували шляхом порівняння часу їх утримання з часом утримання піків контрольних стандартів ЖК фірми Merсk. Кількісну оцінку спектру ЖК ліпідів проводили методом нормування шляхом вимірювання площі піків метильованих похідних ЖК та визначення їх складу у відсотках (%). Похибка визначення становила ? 10,0%.[33,50]
Для визначення нормальних параметрів спектр ЖК ліпідів досліджувався у тих самих біологічних об'єктах в групі контролю, що складалась з 20 практично здорових донорів та добровольців без видимих ознак шкірних захворювань віком від 16 до 45років.
М