РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
Робота виконувалася протягом 2004-2006 років у Інституті біології тварин УААН. Експериментальні дослідження проводились у КТ Племптахорепродуктор "ЕГО", с. Звертів Жовківського р-ну Львівської області (Додаток А, Б). Дослідження напруженості специфічного імунітету проти хвороби Гамборо проводили у Львівській обласній державній лабораторії ветеринарної медицини.
Матеріалом для досліджень були кури з 1- до 129-добового віку кросу ISA BROWN.
Дослідження проводили за схемою, поданою на рисунку 2.1. У 1-му досліді вивчали вікові особливості змін титру напруженості специфічного імунітету проти хвороби Гамборо та біохімічних показників крові курчат кросу ISA BROWN. Для цього використовували проби крові курчат: у 1-, 13-, 25-, 34-, 56-, 71-, 115- та 129-добового віку. У гепаринізованій крові визначали вміст дієнових кон'югатів; у сироватці крові - титр специфічних антитіл, загальний білок, білкові фракції, аланінамінотрансферазу (АЛТ), аспартатамінотрансферазу (АСТ), вітаміни Е та А, малоновий діальдегід, глюкозу; у плазмі крові - гідроперекисі ліпідів.
У 18- та 25-добовому віці були проведені аерозольні вакцинації (вакцина D78, сер.№113227С) птиці проти хвороби Гамборо.
У 2-му досліді вивчали вплив препаратів "Вірон" та "Ізатізон" на біохімічний статус та напруженість імунітету організму курчат проти хвороби Гамборо (рис. 2.1). Після визначення у добовому віці материнського імунітету проти хвороби Гамборо, показників білкового обміну, продуктів ПОЛ, функціональної активності антиоксидантної системи та вуглеводного обміну, за методом аналогів, було створено три групи
Рис. 2.1. Основні етапи проведення досліджень
курчат (контрольну та дві дослідні) по 120 голів у кожній (Додаток А, Б).
Курчатам першої дослідної групи застосовували препарат "Вірон", розроблений Інститутом біології тварин УААН, який створений на основі Ізатізону і містить додатково хлорфіліпт, тривіт, лецитин. Для курчат другої дослідної групи використовували препарат "Ізатізон" (патент України №1786, 29.10.93), виготовлений науково-виробничим об'єднанням "Добродея". Препарати застосовували аерозольно під час критичних імунологічних періодів, до та після проведення вакцинації проти хвороби Гамборо, а саме у 3-, 10-, 16- та 23-добовому віці з розрахунку - 2 мл/м3 площі Вірону та 1 мл/м3 Ізатізону [227]. У 13- та 20-добовому віці була проведена аерозольна вакцинація курчат проти хвороби Гамборо (вакцина Нобіліс Гамборо D78, сер.№041357 А).
Зразки проб крові від курчат отримували шляхом декапітації у пробірки з попередньо внесеними в них 2-3-ма краплями 1%-го розчину гепарину. Для отримання сироватки крові пробірки з цільною кров'ю після обведення витримали 1-ну годину при температурі 37 ?С в термостаті. Для отримання плазми крові, пробірки з цільною кров'ю центрифугували протягом 20-ти хвилин при 3 тис. об/хв ?228?.
2.1. Визначення титру специфічних антитіл проти хвороби Гамборо у сироватці крові. Титр специфічних антитіл у сироватці крові проти хвороби Гамборо визначали методом імуноферментного аналізу із застосуванням наборів "Biochek" [229]. Принцип методу полягає в застосуванні антигенів або антитіл, які ковалентно пов'язані з ферментами (кон'югатів). Якщо на твердій фазі утворився імунний комплекс, то кон'югат поєднується з ним та сприяє його виявленню реакцією ферменту з хромогенним субстратом.
2.2. Визначення загального білка у сироватці крові. Загальний вміст білка у сироватці крові визначали рефрактометричним методом ?230?. В основу рефрактометрії покладено здатність середовищ по різному заломлювати промені світла, що проходять через них.
2.3. Визначення вмісту білкових фракцій у сироватці крові. Визначення вмісту білкових фракцій у сироватці крові проводили у 7,5% поліакриламідному гелі за методом Холода В.М. ?15?. В основі методу лежить здатність білків розділятись на фракції у поліакриламідному гелі під впливом постійного електричного струму. Відсотковий вміст білкових фракцій визначали за допомогою аналізатора фореграм АФ-1, а також перераховували у абсолютні значення (г/л).
2.4. Визначення активності ферментів трансаміназ (АЛТ, АСТ) у сироватці крові. Для визначення активності АЛТ і АСТ у сироватці крові використовували уніфікований динітрофенилгідразиновий метод Райтмана-Френкеля ?231?. У результаті переамінування, за участю АЛТ і АСТ, утворюється щавлевооцтова і піровиноградна кислоти, які при додаванні 2,4-динітрофенилгідразина утворюють в лужному середовищі зафарбовані гідрозони, що мають максимум поглинання при довжині хвилі ?=500-560 нм. Розрахунок активності АЛТ і АСТ у сироватці крові проводили по калібрувальному графіку і виражали у нкат/л.
2.5. Визначення вмісту дієнових кон'югатів у крові. Визначення вмісту дієнових кон'югатів у крові проводили за методом Стальної ?232?, в основі якого лежить властивість спряжених подвійних зв'язків інтенсивно поглинати випромінювання при довжині хвилі ?=233 нм. Для кількісного визначення дієнових кон'югатів використовували коефіцієнт молярної екстинції 2,2?105 моль-1см-1. Концентрацію дієнових кон'югатів у крові виражали у мкмоль/л.
2.6. Визначення вмісту гідроперекисів ліпідів у плазмі крові. Вміст гідропероксидів ліпідів у плазмі крові визначали за методом Мирончика ?233?. Метод ґрунтується на осадженні білків розчином трихлороцтової кислоти та екстракції ліпідів етанолом з наступною взаємодією досліджуваних екстрактів з тіоцинатом амонію.
Обрахунок результатів проводили за формулою:
?Д480 (гідропероксидів ліпідів) = Д480 (дослід) - Д480 (контроль)
Вміст гідропероксидів ліпідів виражали у величинах оптичної густини при 480 нм на 1 мл плазми крові (од. Е 480/мл).
2.7. Визначення вмісту малонового діальдегіду в сироватці крові. Вміст малонового діальдегіду в сироватці крові визначали за методом Коробейнікова ?234?. Ме