ГЛАВА 2
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В диссертации представлен экспериментальный материал, полученный в процессе исследований, проводившихся в 2004-2006 гг. в отделе симбиотической азотфиксации Института физиологии растений и генетики НАН Украины (ИФРГ).
2.1. Объекты исследований
В экспериментах использовали растения сои Glycine max (L.) Merr. сорта Марьяна совместной селекции ИФРГ, Селекционно-генетического института и Института земледелия УААН.
Использовали также активный и неактивный штаммы медленнорастущих клубеньковых бактерий и Tn5-мутант Bradyrhizobium japonicum. В качестве активного использовали штамм 634б из музейной коллекции азотфиксирующих микроорганизмов ИФРГ, а неактивного - штамм 604к, любезно предоставленный сотрудником Крымского филиала Института сельскохозяйственной микробиологии УААН к.б.н. Н.З. Толкачевым. Tn5-мутант штамма 646 (Т66), получен в отделе симбиотической азотфиксации ИФРГ к.б.н. С.М. Маличенко.
В работе применяли лектин семян сои (SBA) и лектин семян гороха (PSL), приобретенные в НПК "Лектинотест" (Львов, Украина), а также альбумин человека (Reanal, Будапешт, Венгрия).
2.2. Условия проведения опытов
В лабораторном опыте с проростками сои семена проращивали в стерильных чашках Петри по 50 штук на фильтровальной бумаге, смоченной стерильной водопроводной водой. Перед проращиванием семена подвергали поверхностной стерилизации 70%-м этанолом в течение 20 мин, после чего многократно промывали стерильной водопроводной водой в течение 60 мин. Семена инокулировали бактериальной суспензией B. japonicum, проинкубированной с гомологичным лектином (метод приготовления бактериальной суспензии описан в пункте 2.3.4). Контролем служили семена, инокулированные бактериальной суспензией, не содержащей лектин. Повторность опытов четырехкратная. Проращивание и снятие показаний производили в соответствии с ГОСТ 12038-84 [94].
Вегетационные и микровегетационные исследования проводили в условиях модельных опытов на вегетационной площадке ИФРГ при влажности субстрата 60% и естественном освещении. Растения выращивали по 6 штук в 15-килограммовых сосудах Вагнера и пластиковых сосудах на 0,7 кг песка. Сосуды предварительно стерилизовали 20%-ным раствором Н2О2. В качестве субстрата использовали промытый речной песок с добавлением минеральной питательной смеси Гельригеля [23], содержащей 0,1, 0,25 или 1,0 норму азота (1 норма соответствует 708 мг Са(NO3)2 ? 4Н2О на 1 кг песка). Перед посевом семена стерилизовали 70%-ным этанолом в течение 15 мин, а затем промывали проточной водой в течение 2 ч. После этого в зависимости от схемы опыта семена сои инокулировали специально подготовленной суспензией соответствующих штаммов B. japonicum, проинкубированной с лектином семян сои, гороха или альбумином человека и выдерживали 60 мин. Контролем служили неинокулировнные растения или растения, инокулированные суспензиями бактерий, не содержащими белков. Отбор растительного материала для анализа производили на 3-и и 10-е сут после появления всходов, а также в фазах бутонизации (40-е сут), цветения (50-е сут) и плодообразования (61-е и 68-е сут).
Микрополевой опыт был заложен на опытном участке ИФРГ. Почва опытных делянок серая лесная, супесчаная, рН 5,9-6,0. Содержание гумуса 1,2-1,5%, фосфора 8,8-10,1, калия 9,4-10,2, легкогидролизуемого азота 10,4-12,6 мг/100 г почвы.
Полевые опыты проводили на агробиологической станции Уманского государственного педагогического университета имени Павла Тычины (Черкасская область). Почва опытных делянок темно-серая, оподзоленная, рН 5,4-5,7. Содержание гумуса 1,6-2,0%, фосфора 9,3-12,2, калия - 13,1-17,6, легкогидролизуемого азота 12,1-12,7 мг/100 г почвы.
Повторность в полевых испытаниях четырехкратная, учетная площадь опытных делянок 5 м2, расположение - рендомезированное. Семена сои высевали из расчета 600 тыс. всхожих семян/га. Для инокуляции семян использовали жидкие биопрепараты и препараты на твердом носителе, модифицированные гомологичным лектином. Отбор растений для анализа производили в фазах 4-го настоящего листа (36-е сут от появления всходов), цветения (52-е сут) и плодообразования (66-е сут).
Все результаты обрабатывали статистически [27], в таблицах и на рисунках представлены средние арифметические и их стандартные ошибки.
2.3. Методы исследований
2.3.1. Физиологические методы
Интенсивность фотосинтеза определяли в контролируемых условиях при помощи установки, смонтированной на базе оптико-акустического инфракрасного газоанализатора ГИАМ-5М (Россия), включенного по дифференциальной схеме. Неотделенную от растения среднюю долю тройчатого листа сои размещали в специальной термостатируемой листовой камере площадью 20 см2, которую освещали лампой накаливания КГ-2000 через водный фильтр. Плотность лучистого потока в камере составляла 1800 мкмоль/(м2 с) ФАР, температура - 25оС. Через камеру продували воздух с естественной концентрацией СО2 со скоростью 1 л/мин.
Для определения транспирации и последующего расчета проводимости листа для СО2 измеряли влажность воздуха термоэлектрическим микропсихрометром до и после прохождения через камеру.
Расчеты параметров газообмена выполняли по общепринятой методике [102]. Для измерений отбирали закончившие рост листья без видимых признаков старения. Определения проводили в трехкратной биологической повторности.
Биометрические показатели - массу сырого вещества надземной части растений, корней и клубеньков определяли в пяти- десятикратной повторности.
2.3.2. Биохимические методы
Азотфиксирующую (нитрогеназную) активность определяли по уровню ацетиленвосстанавливающей активности (АвА) корневых клубеньков ацетиленовым методом [95, 143].
Корни растений с клубеньками помещали в герметично закрывающиеся стеклянные флаконы емкостью 75 см3, в которые через резиновую прокладку вводили 10% ацетилена. Продолжительность инкубации - 1 ч. После инкубации газовую смесь, содержащую этилен, образова