РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ)
2.1. Общие замечания
Растительный материал (листья, стебли и плоды) Kalopanax septemlobum (Thunb.) Koidz. var. maximowiczii (Van Houtte) Hara и K. septemlobum
var. typicum (Nakai) Pojark., собран на Южном берегу Крыма (Никитский ботанический сад).
ТСХ-анализ и контроль разделения гликозидов выполняли на пластинках "Silufol" (Чехословакия) и "Sorbosil" (Великобритания). Двумерный ТСХ-анализ [114, 115] экстрактов и отдельных фракций проводили при использовании в одном направлении нейтральной хроматографической системы растворителей и в перпендикулярном направлении - щелочной системы растворителей. В качестве нейтральной системы использовали смесь хлороформ-метанол-вода (100:30:5 для гликозидов с 1-4 сахарными остатками и 100:40:7 для гликозидов с 4-6 сахарными остатками); в качестве кислой - хлороформ-метанол-вода (100:30:5 или 100:40:7 с добавлением 3-5% муравьиной кислоты непосредственно перед хроматографированием), и щелочной - хлороформ-метанол-25%-ный водный аммиак (100:40:10), хлороформ-этанол-10%-ный водный аммиак (100:50:15), бензол-ацетон (4:1) [5].
Детектирование пятен тритерпеновых гликозидов и их агликонов на хроматограммах осуществляли 10%-ным спиртовым раствором фосфорновольфрамовой кислоты с добавлением 2% пара-гидрокси-бензальдегида с последующим нагреванием хроматограмм при 100-120°С [5]. Детектирование сахаров проводили 10%-ным спиртовым раствором кислого фталата анилина с последующим нагреванием хроматограмм при 100-150°С [5].
Препаративное разделение очищенной суммы и фракций тритерпеновых гликозидов проводили на силикагеле L ("Chemapol", Чехословакия) (40-
100 мкм), дополнительная очистка и рехроматография проводилась на микросферическом силикагеле "Silpearl" (Чехия). Использовали следующие системы растворителей - градиентное элюирование системой растворителей хлороформ-изопропиловый спирт (10:1?1:1), насыщенной водой, хлороформ-изопропиловый спирт (10:1>1:1), насыщенной 10%-ным водным аммиаком, хлороформ-этиловый спирт (7:1?1:1), насыщенной водой [5].
Для ферментативного гидролиза использовали: ферментный препарат (сумма глюкозидаз) из гепатопанкреатического сока виноградной улитки (Helix pomatia) [116], эмульсин (?-глюкозидаза из семян видов сем. Rosaceae, КФ 3.2.1.21) [117, 118], ферментный препарат из мицелия гриба Mukor spp. и Aspergilus niger [119, 120], содержащий экзорамнозидазу и ферментный препарат из листьев и семян плюща (гликозидаза, расщепляющая ацилгликозидную связь).
Гемолитическую активность выделенных гликозидов сравнивали с действием препарата "Saponin" (изготовитель - фирма "Chemapol", Чехословакия), содержащего сумму тритерпеновых гликозидов из корней двух видов гипсофиллы - восточно-европейской Gypsophilla paniculata и средне-восточной Gypsophilla arrosti (Caryophyllaceae).
Спектры ЯМР получены на приборе "Bruker" DRX-500, с рабочей частотой прибора 500 МГц. Для двумерных экспериментов COSY, TOCSY, ROESY, HSQC и HMBC использовали пакеты стандартных программ фирмы "Bruker". Использовали растворы гликозидов в пиридине-d5 с добавлением внутреннего стандарта - тетраметилсилана.
Спектры поглощения в видимой и ультрафиолетовой области получены на приборе "Specord UV VIS".
2.2.
Общие химические методы
2.2.1. Щелочной гидролиз. Осуществляли путем добавления к 1 мг гликозида 0,2 мл 10%-ного раствора КОН в смеси вода-метанол (1:1) и нагревания при 100°С в течение 2 ч. Полученный раствор разбавляли 5-ти кратным количеством воды и нейтрализовали 1 н. водным раствором Н2SO4 до слабокислой реакции. Экстракцию прогенинов осуществляли 5-10-ти кратным количеством бутанола. Бутанольный экстракт анализировали с помощью ТСХ.
2.2.2. Дезацилирование (аммонолиз). Проводили растворением 1 мг гликозида в 0,2 мл 10%-ного водно-спиртового (1:1) раствора аммиака и выдерживали при 20°С в течение 2-3 ч. Раствор нейтрализовали катионитом (КУ-2-8) в Н+-форме и фильтрат анализировали ТСХ в системе хлороформ-метанол-вода.
2.2.3. Полный кислотный гидролиз. Для определения сахаров полный кислотный гидролиз осуществляли путем растворения гликозидов в смеси диоксан - 4 н. водная CF3COOH (1:1) при 100oС в течение 2 ч. Сахара в гидролизате без предварительной обработки идентифицировали с помощью ТСХ в сравнении с заведомо известными образцами сахаров. Для идентификации агликонов полный кислотный гидролиз осуществляли путем растворения гликозидов в смеси метанол - 2 н. водная H2SO4 с последующим нагреванием в течение 2 ч. при 100oС. Далее полученный гидролизат разбавляли 3-х кратным объемом воды и экстрагировали агликоны 5-ти кратным объемом хлороформа. Идентификацию агликонов осуществляли с использованием ТСХ анализа в сравнении с заведомыми образцами.
2.2.4. Метилирование диазометаном. Метилирование проводили путем добавления к гликозиду, растворенному в 90%-ном водном метаноле, избытка эфирного раствора CH2N2 до появления устойчивой желтой окраски [121]. После упаривания остаток анализировали с помощью ТСХ.
2.2.5. Ферментативный гидролиз. Ферментативный гидролиз осуществляли путем растворения гликозида в 100 кратном количестве воды, добавления 5-10-ти кратного весового количества соответствующего фермента, тщательного перемешивания смеси и выдерживания при 40-50оС в течение от нескольких часов до суток с контролем ТСХ. После завершения процесса добавляли 3-5-ти кратный объем метанола, нагревали до кипения и отделяли денатурированный фермент центрифугированием. Супернатант упаривали досуха и продукты ферментолиза анализировали с помощью ТСХ.
2.3. Выделение, разделение и очистка сапонинов из различных органов двух разновидностей калопанакса семилопастного
2.3.1. Выделение гликозидов из коры стеблей Kalopanax septemlobum var. maximowiczii. 200 г воздушно-сухой коры стеблей тщательно измельчили и обработали бензолом (4х1000 мл). Обезжиренный остаток экстрагировали 80%-ным водным изопропиловым спиртом
(4х1000 мл) и после упаривания объединенны
- Київ+380960830922