Розділ II
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
ЯКІСНЕ, КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ТА ВИДІЛЕННЯ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН З ЛИСТЯ РОБІНІЇ ЗВИЧАЙНОЇ
Об'єктом дослідження були листя робінії звичайної, зібрані поблизу м. Харкова, в Харківській, Полтавській, Дніпропетровській областях, у ботанічному саду Національного державного університету ім. В.Н. Каразіна. Сировину збирали протягом п'яти років (2002-2006 р.р.). Заготівлю проводили в період з червня по жовтень. Листя висушували у затінку при температурі +18-25?С.
Для попереднього фітохімічного вивчення листя робінії звичайної на вміст різних класів біологічно активних сполук готували водні, водно-спиртові витяги з повітряно-сухої сировини. Виявлення наявності природних речовин встановлювали за допомогою загально прийнятих специфічних якісних реакцій, кількісного визначення та методів хроматографічного аналізу [23-25, 41, 64, 65].
Листя робінії звичайної досліджували на вміст флавоноїдів [19, 22, 52, 99, 100], кумаринів [17, 18, 22, 56], гідроксикоричних кислот [6, 53], дубильних речовин [90], амінокислот [12, 39, 99], сапонінів [41, 90] та інших сполук.
2.1. Отримання екстрактів для проведення якісних реакцій на деякі класи природних сполук
Отримання водних екстрактів. 50,0 г сухого листя, подрібненого до розміру частинок 1-2 мм, заливали 10-кратною кількістю води та нагрівали в колбі зі зворотним холодильником на киплячому водяному огрівнику протягом 30 хвилин. Отриманий витяг фільтрували через складчастий фільтр. Екстракцію сировини проводили ще два рази новими порціями розчинника. З'єднаний витяг концентрували у вакуумі до 100 мл і використовували для виявлення вуглеводів, амінокислот, дубильних речовин.
Отримання спирто-водних екстрактів. Екстракцію 50,0 г сухого листя проводили 70 % етиловим спиртом аналогічно методиці, описаній вище. З'єднаний витяг концентрували у вакуумі до 100 мл. 50 мл отриманого витягу залишали для дослідження, а другу частину випарювали у вакуумі до густого залишку, випавший осад хлорофілів і ліпофільних речовин відфільтровували.
Отримані 50 мл фільтрату обробляли у ділильній воронці 10 раз хлороформом порціями по 50 мл. Після обробки водний залишок нагрівали на киплячому водяному огрівнику до видалення слідів хлороформу, охолоджували і послідовно екстрагували етилацетатом і н-бутанолом.
З'єднані хлороформні, етилацетатні та бутанольні фракції, а також водний залишок упарювали у вакуумі до густого залишку і використовували для проведення якісних реакцій.
2.2. Білки
Визначення білка проводили методом Лоурі. 10 мг (точну наважку) сировини двічі екстрагували 50 мл води дистильованої. Отримані екстракти поєднували і визначали вміст білка. 1 мл з'єднаного екстракту поміщали в мірну колбу і доводили обсяг водою до 40 мл. Визначення проводили за методикою, наведеною у ДФ XІ [24], с. 31.
Вміст білка з урахуванням розведень визначали за графіком (рис. 2.1), який будували у межах концентрацій від 0,025 до 0,25 мг стандартного розчину бичачого сироваткового альбуміну (Sіgma), обробленого як дослідний препарат.
Рис. 2.1. Вміст білка з урахуванням розведень стандартного розчину бичачого сироваткового альбуміну
Експериментальні дані обробляли за допомогою комп'ютерної програми "Orіgіng", яка обчислює коефіцієнти регресивного рівняння Y=A+B*X, їх довірчі інтервали, стандартні відхилення і будує графік лінійної залежності. Знайдена за графіком концентрація білка дорівнює 0,25 мг/г.
Розрахунок вмісту білка у сировині обчислювали за формулою:
мг/г сировини,
де С1 - концентрація білка, знайдена за графіком.
Вміст білка у листі робінії звичайної складає 10,30 %.
2.3. Амінокислоти
Вивчення якісного амінокислотного складу водного екстракту проводили методом висхідної хроматографії на папері Filtrak FN-4 у системі розчинників: н-бутанол - оцтова кислота - вода (4:1:2). Хроматограми обробляли 0,2% розчином нінгідрину в ацетоні і висушували в сушильній шафі при температурі 60-80?С. Амінокислоти ідентифікували з завідомо відомими зразками за забарвленням плям і визначенням їх Rf. Одержані дані наведені в табл. 2.1.
Таблиця 2.1
Якісний та кількісний вміст амінокислот у листі робінії звичайної
№Назва амінокислотиЗагальна формулаRf
БОВ (4:1:2)Вміст амінокислоти, % на суху вагузв'язанівільні1. Аспарагінова кислотаС4Н6О4N0,161,5130,3502. ТреонінС4Н9О2N0,180,4800,2053. СерінС3Н7О3N0,150,7530,2554. Глутамінова кислотаС5Н8О4N0,173,4911,0805. ПролінС5Н9О2N0,240,947-6. ГліцинС2Н5О2N0,210,6050,0827. АланінС3Н7О2N0,201,6750,2048. ВалінС5Н11О2N0,430,6930,2829. МетіонінС5Н10О2NS0,390,3480,31010. ІзолейцинС6Н13О2N0,720,6130,28511. ЛейцинС6Н13О2N0,641,6310,04712. ТірозинС9Н13О3N0,570,6690,64013. ФенілаланінС9Н12О2N0,320,7830,28614. ГістидинС6Н11О2N30,100,3150,07215. ЛізинС6Н13О2N20,050,5730,14516. АргінінС6Н15О2N40,040,5520,244
Кількісний вміст амінокислот у досліджуваній сировині проводили за допомогою амінокислотного аналізатора LKB 4151 "Альфа Плюс" (Швеція) на колонці, заповненій іонообмінною смолою марки DCGA. Для проведення дослідження сировину попередньо витримували у сушильній шафі при температурі 105°С протягом 2-3 год.
Зв'язані амінокислоти. 0,1 г (точна наважка) висушеної сировини обробляли за методикою, наведеною у роботах [12, 39].
Рис. 2.2. Хроматограма визначення вмісту зв'язаних амінокислот в листі робінії звичайної
Вільні амінокислоти. 5,0 г (точна наважка) сухої, подрібненої сировини тричі обробляли 70% етанолом по 10 мл. Отримані витяги з'єднували, центрифугували та випарювали на водяній бані при температурі 80?С досуха. Подальше виявлення вільних амінокислот проводили як описано вище [12, 39, 55].
Рис. 2.3. Хроматограма визначення вмісту вільних амінокислот в листі робінії звичайної
Результати досліджень амінокислотного складу листя Robinia p