РОЗДІЛ 2
ДОСЛІДЖЕННЯ РЕЧОВИН ПЕРВИННОГО СИНТЕЗУ ЛИСТКІВ БАДАНУ
2.1 Дослідження амінокислотних сполук
2.1.1 Загальні методи аналізу амінокислот
Хроматографічні методи знайшли широке застосування в аналізі вільних
амінокислот, а також амінокислотного складу пептидів і білків різного
походження. При цьому велике поширення набули паперова, тонкошарова,
іонообмінна на колонках і у фіксованому шарі іонообмінника (на пластинках
«Фіксіон») хроматографія. [71].
Для якісного аналізу амінокислот широко використовується хроматографія на
папері. При цьому використовують низхідну, висхідно-низхідну, горизонтальну
хроматографії, одномірний і двовимірний поділ амінокислот, багаторазовий
розвиток хроматограми [72].
Папір заслуговує особливої уваги у аналізі амінокислот. Так, для кількісного
мікроаналізу амінокислот надзвичайне значення має відсутність у папері
металевих комплексів, що змінюють інтенсивність забарвлення амінокислотних плям
після прояву хроматограми нінгідрином. Багато сортів хроматографічного паперу
можуть бути використані тільки після попереднього звільнення його від катіонів
металів. Для цієї мети використовують обробку паперу 8-оксихіноліном, що в
лабораторних умовах дуже трудоємко і займає багато часу. Тому, велику перевагу
має застосування хроматографічного паперу, що складається з чистої целюлози,
здатної забезпечити гарний поділ речовин [73].
Як розчинник при аналізі амінокислот використовували систему н-бутанол –
оцтова кислота – вода (БОВ) у різних співвідношеннях (4:1:1; 4:1:5; 12:2:5;
18:2:5; 25:3:25); а також застосовували й інші системи [71, 72,74]:
н-бутанол – піридин – вода 1:1:1;
н-бутанол – піридин – оцтова кислота – вода 15:10:3:12;
бутанол – аміак 3:1;
бутанол – вода - мурашина кислота 14:3:3 і 139:59:2;
ізоаміловий спирт – піридин – вода 7:7:6;
н-пропанол – вода 7:3;
етанол – вода 77:33;
фенол - вода 4:1.
Перед проявом хроматограму ретельно висушували для видалення розчинника. Як
розчинник використовували водний фенол, хроматограму висушували при кімнатній
температурі, щоб запобігти розкладання деяких амінокислот.
Для виявлення амінокислот застосовували наступні методи:
занурення хроматограм у розчинник, який містив реагент;
обприскування хроматограми реактивом;
поміщення хроматограм на вологий лист паперу, просочений відповідним реагентом.
Як проявники використовували неспецифічні і специфічні реагенти. Широко відомим
реактивом на амінокислоти є нінгідрин, що часто використовується при аналізі
рослинної сировини. При прояві хроматограм нінгідрином застосовували його
розчини [71,74,75]:
1) 0,25% розчин нінгідрину в ацетоні, що містить 5% піридину, лутидину чи
коллидину; хроматограму нагрівали при 35 °С протягом 1 години у вологій камері
і витримували у темряві протягом ночі.
2) 0,5% розчин нінгідрину в 95% ацетоні з додаванням 1-4% крижаної оцтової
кислоти (застосовують при наявності у препараті значної кількості лугу чи при
використанні для просочування паперу буферних розчинів, які містять солі лужних
металів).
3) 0,3% спиртовий розчин нінгідрину; розвиток забарвлення на хроматограмі при
кімнатній температурі відбувається в темряві протягом 18 годин.
4) 0,1% водний розчин нінгідрину; після прояву хроматограму нагрівають до появи
плям;
5) кадмій – нінгідрин (до 1% ацетонового розчину нінгідрину додають ацетат
кадмію й оцтову кислоту).
6) 2% водний розчин нінгідрину, що містить двохлористе олово.
При використанні такого проявника як нінгідрин, виникала проблема збереження
забарвлення амінокислот. Для його закріплення застосовували обробку хроматограм
розведеним розчином нітрату міді (до 1 мл насиченого розчину нітрату міді
додавали 0,2 мл 10% азотної кислоти і доводили етанолом до 100 мл. Для
нейтралізації кислот, папір швидко обробляли парами аміаку і потім протягом 3
годин витримували в темряві. Внаслідок переходу нінгідринового комплексу в
мідний, забарвлення плям змінюється від синього до червоного [71,72].
Специфічні реагенти широко використовують при кількісному визначенні відомої
амінокислоти. У якісному аналізі кислот широко застосовують 3-4 реагенту, якими
послідовно виявляють хроматограми. Об'єктами дослідження служили листки
наступних видів: Bergenia crassifolia, Bergenia stracheyi, Bergenia ciliata,
Bergenia delavayi x media, Bergenia hymalaiса, Bergenia paсifica.
Кількісний вміст білка в листках і екстрактах бадану визначали методом Лоурі і
за Кельдалем [12,13].
2.1.2. Якісне визначення амінокислот
Для якісного хроматографічного визначення амінокислот у листках представників
роду бадан були отримані водні екстракти з подрібненої сировини. Для цього 1,0
г тонко подрібненої сировини (що проходить крізь сито з діаметром отворів 2 мм)
заливали 20 мл води, нагрівали на киплячій водяній бані протягом 30 хвилин у
колбі зі зворотним холодильником, витяг охолоджували і фільтрували в колбу.
Потім концентрували до густого залишку, що розчиняли в невеликому об’ємі води
(4-5 мл).
Як стандарти використовували розчини амінокислот (серин, орнитин, метіонін,
валін, треонін, лейцин, ізолейцин, пролин і гістидин) у 0,1 н розчині
хлореводневої кислоти [76].
Для хроматографічного розділу використовували висхідну хроматографію на папері
Filtrak FN-4, дво- і триразове пропущення розчинника. Застосовували наступні
системи розчинників: 1) н-бутанол – оцтова кислота – вода 4:1:2, (БОВ);
2) н-бутанол – оцтова кислота – вода 18:2:5.
Амінокислоти виявляли обробкою 0,1% водним розчином нінгідрину, після
хроматограму нагрівали до появи плям. У результаті була встановлена наявність
13 амінокислот у листках представників роду бадан. Результати дослідження
наведені в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Якісний хроматографічний
- Київ+380960830922