РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Вибір напрямків досліджень
Наукові дослідження виконували протягом 2003-2006 рр. в науковій лабораторії кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології факультету ветеринарної медицини Державного вищого навчального закладу "Державний агроекологічний університет" та на базі ЗАТ НВП "Райз-Агро" (Ягільницький кінний завод), с. Нагірянка Чортківського району Тернопільської області. Також були досліджені коні племінних ферм на території Житомирської області. Імуноферментний аналіз проб сироватки крові коней до ГВК-1 був проведений у відділі імунологічних і моніторингових досліджень Центральної Державної лабораторії ветеринарної медицини.
2.1.1. Віруси
В дослідах був використаний герпесвірус коней першого типу (штами "СВ-69" та "Буковина"). Штам "Буковина" виділений 4.07.94 р. з вагінальних змивів кобили "Буковина" на перещеплюваній культурі клітин трахеї теляти. Виділив штам О.Є. Галатюк в лабораторії Інституту епізоотології Української академії аграрних наук. Штам "СВ-69" отриманий з культуральної аутенуйованої вакцини. Титр інфекційної активності на перещеплюваній культурі клітин трахеї теляти цих штамів становив 5?104 - 5?109 ТЦД50/см3, гемаглютинуючий титр вірусу становив 4 ? 32 ГАО. Віруси зберігали в замороженому стані при температурі - 96?С.
2.1.2. Тварини
Ураженість коней герпесвірусом першого типу вивчали за даними ретроспективного дослідження поголів'я коней різновікових та породних груп. Всього досліджено в РЗГА 855, в РН - 30, в РДП - 60, в ІФА - 10 проб сироватки крові коней.
2.1.3. Культури клітин
1. Перещеплювана культура фібробластів шкіри коня (отримана з Варшавського державного аграрного університету, люб'язно надана зав. кафедрою вірусології професором Марчіном Банбурою).
2. Перещеплювана культура клітин трахеї теляти (отримана з Обласної державної лабораторії ветеринарної медицини м. Житомира, зав. вірусологічним відділом Васянович М.О.).
2.1.4. Сироватки крові
Сироватку крові ВРХ, що використовували для культур клітин, отримували з проб крові, відібраної від бичків клініки великих тварин факультету ветеринарної медицини Державного вищого навчального закладу "Державний агроекологічний університет". Сироватку крові очищали за допомогою ПЕГ-6000 та інактивували при температурі 56?58?С протягом 40?60 хвилин [14]. Сироватки крові коней та кролів перед дослідженнями в РЗГА та РН інактивували на водяній бані при температурі 56?58?С протягом 30 хвилин.
2.2. Постановка реакції гемаглютинації (РГА)
Для постановки РГА використовували еритроцити коня, які отримували наступним чином. Стабілізовану гепарином кров розбавляли фізіологічним розчином натрію хлориду 1:4 - 1:5 і центрифугували при 200g протягом 10 хвилин. Обережно, за допомогою пастерівської піпетки видаляли надосадову рідину з шаром лейкоцитів, які знаходились на поверхні еритроцитів. Цю процедуру здійснювали тричі. Із осаду суспензії еритроцитів, яку рахували 100%, готували необхідну робочу суміш еритроцитів, частіше 0,2?0,3%.
Реакцію проводили на мікропланшетах з луночками із органічного скла. Для постановки реакції в усі лунки вносили по 0,02 см3 фізіологічного розчину, далі розтитровували вірусвмісний матеріал від 1:2 до 1:256, переносячи його автоматичною піпеткою по 0,02 см3, для перемішування компонентів шляхом струшування мікропланшетів і через 60 хв. в усі луночки вносили по 0,02 см3 0,2?0,3% суспензії еритроцитів коня. Поряд з дослідом ставили контролі:
1. 0,02 см3 суміші еритроцитів з 0,02 см3 фізіологічного розчину;
2. 0,02 см3 вірусу з 0,02 см3 еритроцитів на здатність аглютинувати;
3. 0,02 см3 еритроцитів на спонтанну аглютинацію.
Панелі залишали при кімнатній температурі на 60?90 хв. Результати реакції враховували після повного осідання еритроцитів у контрольних лунках і оцінені таким чином:
+++ ? всі еритроцити аглютиновані і утворюють суцільний шар ("парасольку");
++ ? більшість еритроцитів аглютинована й утворює "парасольку", по краях якої відмічається тонке кільце з неаглютинованих еритроцитів;
+ ? більшість еритроцитів не аглютинована та утворює осад у вигляді "ґудзика", по краях якого є незначна "парасолька";
- ? всі еритроцити не аглютиновані й осіли у вигляді "ґудзика" з нерівними краями.
За одну гемаглютинувальну одиницю брали найбільше розведення вірусу, яке спричинювало чітко виражену гемаглютинацію (не менше ніж на 2 плюси). Показником гемаглютинувального титру вірусу було число, обернено пропорційне його розведенню [18, 22].
2.3. Постановка реакції затримки гемаглютинації (РЗГА)
Сироватку перед дослідженням інактивували на водяній бані 30 хвилин при температурі 56?58?С. Для постановки реакції в усі лунки вносили по 0,02 см3 фізіологічного розчину, далі розтитровували сироватку від 1:2 до 1:1024, переносячи її автоматичною піпеткою по 0,02 см3. В усі лунки вносили по 0,02 см3 вірусу, який містить 4 ГАО. Для перемішування компонентів плати струшували і витримували протягом 60 хв. у термостаті при температурі 37?С. Потім в усі луночки вносили по 0,02 см3 0,3% суспензії еритроцитів коня. Лишали при кімнатній температурі, перший облік реакції проводили через 3?4 години, повторно ? через 24 години. За титр антитіл брали найвище розведення сироватки, яке спричинювало повну затримку гемаглютинації. Ставили контроль робочої дози вірусу. Для цього готували двохразові розведення робочої дози вірусу 4 ГАО на 0,9% розчині натрію хлориду в об'ємі 0,02 см3. В усі лунки вносили по 0,02 см3 0,3% суспензії еритроцитів коня [18, 22]. При правильному виборі робочої дози вірусу в першій і другій лунках, які містять відповідно по 2 ГАО і 1 ГАО, повинна бути чітка гемаглютинація (на 3 і 2 плюси), а в третій і четвертій лунках, що містять 0,5 ГАО і 0,25 ГАО, гемаглютинації не повинно бути. Якщо отримували інші результати здійснювали корекцію дози вірусу, збільшивши чи зменшивши його концентрацію в залежності від ситуації. Для контролю еритроцитів на с