РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
Експериментальна частина роботи виконана з 2003 по 2006 рік в лабораторії імуногенетики Інституту тваринництва степових районів ім. М. Ф. Іванова "Асканія-Нова" - Національного наукового селекційно-генетичного центру з вівчарства. Дослідження проводилися на вівцях кросбредного та чорноголового типів асканійської м'ясо-вовнової породи з кросбредною вовною племзаводів "Асканія-Нова" та "Маркеєво" Чаплинського району Херсонської області. В цих стадах за еритроцитарними антигенами п'яти систем груп крові (A, B, C, D, R) та типами поліморфних білків (Hb, Tf) та ферментів (AEs, Ap) крові типовано 1306 голів різних статево-вікових груп, у тому числі: 25 баранів, 777 вівцематок, 318 ярок, 186 баранців.
У господарствах налагоджено відповідний племінний та зоотехнічний обліки, в останні роки створено оптимальні умови годівлі та утримання.
Матеріалом досліджень слугували індивідуальні зразки крові овець, дані первинного зоотехнічного та племінного обліку, а також перспективні плани та програми племінної роботи з відповідними стадами овець досліджуваного генофонду [199].
Схема досліджен представлена на рисунку 2.1.
Визначення груп крові овець здійснювали з використанням виготовлених в інституті "Асканія-Нова" імунодіагностикумів для диференціювання еритроцитарних антигенів овець згідно методичних вказівок по контролю за походженням ягнят з використанням груп крові та поліморфних білків та методичних вказівок з використання антигенних еритроцитарних факторів та поліморфних систем білків і ферментів крові в селекції овець [113, 168].
Рис.2.1. Схема досліджень
Зразки крові на імуногенетичний аналіз відбирали від здорових тварин у пробірки з консервантом (4-5 мл). Склад консерванту: натрій лимоннокислий трьохзаміщений - 30 г; глюкоза - 10 г; стрептоміцин - 500000 од.; дистильована вода - 1000 мл.
Після взяття крові вміст пробірки ретельно перемішували, щоб запобігти коагуляції. Кожний зразок крові мав етикетку із зазначенням номеру тварини, всі необхідні дані про яку заносили перед відбором крові до відомості відбору крові.
Зразки для визначення поліморфізму білків та ферментів крові відбирали у сухі, чисті пробірки без антикоагулянту. Отримані проби аналізували методом горизонтального електрофорезу на крохмальному гелі.
Джерелом постійного струму був серійний випрямляч УИП-І. Як катодний, так і анодний електроди виготовлені із платини. В якості носія використовували гель, приготовлений із частково гідролізованого крохмалю.
При визначенні поліморфізму трансферину, гемоглобіну та лужної фосфатази використовували електролітний та трис-цитратний буфери за Gahne [276]. Горизонтальний електрофорез сироваточної арілестерази проводили з використанням буферних розчинів за Смітісом [324].
Електрофорез гемоглобіну та трансферину. Буфер для гелю готували із суміші 1 частини електролітного буферу та 5,25 частин трис-цитратного. Для заварки 13% гелю у жаростійкій колбі місткістю 0,5 л змішували 39 г частково гідролізованого крохмалю із 300 мл буферного розчину. Після утворення рівномірної суспензії її нагрівали при постійному збовтуванні до утворення тягучої світлої гомогенної маси. Потім, з допомогою електричного вакуум-насосу з колби відкачували повітря до енергійного закипання гелю. Гарячий гель розливали у лотки з внутрішніми розмірами 300 х 160 х 5 мм і відразу ж накривали змазаною вазеліновим маслом поліетиленовою плівкою, а потім склом з вагою.
Через 10 хвилин вага знімалася, лотки поміщалися у холодильних (+2 +4ОС) для достигання гелю. Після цього, через 30 хвилин гребінкою-шаблоном проколювалися ямки, у які на папірці розміром 5 х 5 мм наносилися зразки плазми або еритроцитів крові.
З'єднання гелю з електролітом здійснювалося з допомогою хроматографічного паперу із 6 шарів.
На початку електрофорезу установлювали силу струму з розрахунку 120 мА на одну кювету. Для охолодження гелевих пластин використовували активне вентилювання та бавовняні серветки, які по мірі висихання змочувалися водою. Тривалість електрофорезу 2,0-2,5 години.
По закінченню електрофорезу для визначення типів трансферину гелеву пластину розрізали на два шари в горизонтальній площині, фарбували їх насиченим розчином нігрозину у промивній рідині (метанол, дистильована вода та льодова оцтова кислота у співвідношенні 5:5:1) протягом 3-5 хвилин. Потім відмивали фореграми промивною рідиною.
При визначенні типів гемоглобіну зразки крові наносили у три ряди.
Визначення типів сироваточної арілестерази. Використовуючи гелевий розчин (0,5 М ТЕБ; pH 7,9; розведення 1:10) готували крохмальний гель. Паперові містки у три шари. Зразки наносили в один ряд на відстані 1,5-2,0 см від катодного краю пластини. Початкова сила струму - 40 мА, напруга - 300 в. Тривалість електрофорезу - 3,0-3,5 години.
Фарбування зон арілестеразної активності виконували з використанням -нафтілацетату (40 мг) та міцної синьої ВВ солі (200 мг), розчинених у 4 мл ацетону з доданням 200 мл дистильованої води. Гелеву пластину, розрізавши на два шари, занурювали у даний розчин і витримували у термостаті при температурі 37ОС протягом 40-45 хвилин.
Визначення типів лужної фосфатази. Електрофорез здійснювали у 15% крохмальному гелі. Склад буферних систем, заварка гелю та процес його формування аналогічні вищенаведених методик. Нижче описано окремі особливості даної методики.
Паперові містки у 4 шари. Активне вентилювання з водяним охолодженням. Сила струму 100 мА на кожну пластину. Напруга - 380-400 в. Тривалість електрофорезу - до просування баратної лінії на 7 см від лінії старту.
Після закінчення електрофорезу пластину гелю розрізали на два шари та інкубували у термостаті при t - 37ОС (до чіткого проявлення зон, 1,5-2,0 години) у 200 мл субстрату, до якого входили: тріс (оксіметіл-амінометан) -1,84 г; лимонна кисло