РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Всі дослідження по даній роботі були проведені у відділі новітніх біотехнологій Харківського біотехнологічного центру УААН та у відділі біотехнології репродукції сільськогосподарських тварин Інституту тваринництва УААН. Робота виконувалася протягом 2001 - 2006 рр.
Дослідження передбачали:
1. Отримання та пасування культури ембріональних фібробластів миші з метою її використання у якості фідерного моношару для культивування тотипотентних клітин миші.
2. Отримання ЕС-подібних клітин миші та їх довгострокове пасування.
3. Культивування in vitro бластомерів, ізольованих від 2-, 4- та докомпактизаційних 8-клітинних ембріонів миші.
2.1. Об'єкти досліджень
Дослідження були проведені на ембріональному матеріалі, що отримували від зародків лабораторних мишей (Mus muskulus) відповідних стадій розвитку. Миша є стандартним модельним об'єктом у біологічних та біотехнологічних дослідженнях, і, хоча пряма екстраполяція на інші види ссавців даних, отриманих у дослідженнях на цьому виді, неправомірна, одержані результати можливо розцінювати як характерні для плацентарних ссавців. Експерименти на тваринах проводили відповідно до правил "Європейської конвенції захисту хребетних тварин, що використовуються з експериментальною та іншою метою" [82].
У якості об'єктів для досліджень нами були обрані ембріональні фібробласти миші; бластомери, ізольовані від ембріонів миші на 2-х-, 4-х- та ранній (докомпактизаційній) 8-миклітинній стадіях ембріогенезу; ембріони миші на стадії бластоцисти; клітини внутрішньої клітинної маси ембріонів та ЕС-подібні клітини миші.
У дослідах були використані миші дикого типу та лінії СВА, яких утримували у стандартних умовах віварію. Ембріони на різних стадіях розвитку отримували після запліднення у фізіологічних умовах (in vivo) самиць у віці 6 - 8 тижнів, що знаходилися у стані еструсу. Для отримання достатньої кількості ембріонів на стадіях розвитку 2, 4, 8 клітин та бластоцисти самиць піддавали гормональній стимуляції множинної овуляції (суперовуляції). Для цього самкам внутрішньочеревно вводили гонадотропін сироватки жеребих кобил (ГСЖК) і, через 46 - 48 годин, хоріогонічний гонадотропін людини (лХГ). Доза кожного з гормонів становила 5 МО [7].
Самиць підсаджували індивідуально до самців для спарювання і ранком наступного дня перевіряли наявність копулятивної (вагинальної) пробки. День виявлення копулятивної пробки вважали першим днем вагітності [7].
Всі маніпуляції експериментальних дослідів були проведені у спеціальному стерильному боксі та стерильних умовах при температурі не нижче ніж 240С. Стерилізацію боксу забезпечували за допомогою ультрафіолетового опромінювання. Перед началом роботи стіл та інструменти обробляли 700-ним етанолом. Інструменти стерилізували кожен раз, як тільки вони стикалися з не стерильною поверхнею. Скляний посуд та пастерівські піпетки стерилізували сухим жаром. Середовища для маніпуляцій та культивування стерилізували фільтруванням за допомогою мембранного фільтру з порами діаметром 0,22 мкм (Millipore) [7, 37]. Культивування проводили в одноразових пластикових стерильних чашках Петрі діаметром 35 мм та одноразових пластикових культуральних планшетах, які містили чотири лунки, кожна діаметром 10 мм.
У всіх дослідженнях використовували реактиви для культивування ембріонального матеріалу фірми Sigma.
2.2. Отримання та пасування культури ембріональних фібробластів миші
Для отримання ембріональних фібробластів миші були використані ембріони віком 12,5 - 14,5 діб [53, 145]. Самиць забивали зміщенням шийних хребців, хірургічним шляхом видаляли матку з зародками та переносили її до чашки Петрі діаметром 50 мм з теплим (370С) середовищем РВS + 10% FCS [7]. Інактивацію фетальної сироватки теляти проводили нагріванням при температурі 560 С протягом 30 хвилин [3].
Матку надрізали скальпелем по антимезометріальному краю кожного місця імплантації, пінцетом видаляли децидуальні капсули з зародками та переносили до нової чашки Петрі з теплим свіжим середовищем РВS + 10% FCS. Потім пінцетом розривали децидуальні капсули, обережно виштовхували зародки та препарувальною голкою руйнували оболонки Рейхарта. Виділені зародки переносили до такого ж теплого свіжого середовища та скальпелем і препарувальною голкою видаляли голови, кінцівки й кров'яні скупчення [7, 53].
Ембріональний матеріал, що залишався, переносили до свіжого теплого середовища РВS та роздроблювали як можна більше механічним шляхом за допомогою скальпелю з утворенням шматочків розміром близько 1 мм.
Також проводили трипсинізацію отриманого механічним шляхом ембріонального матеріалу. Для цього ембріональний матеріал інкубували у розчині 0,25% трипсин - 0,2% ЕDТА при 370С протягом 5, 10, 20 та 30 хвилин [12, 53].
Після цього клітини оцінювали на життєздатність за допомогою стандартного тесту забарвленням 0,1% розчину трипанового синього [1]. Забарвлені клітини оцінювали як мертві (нежиттєздатні). Кількість життєздатних клітин підраховували за формулою [45]:
життє-
здатність клітин=
(загальна кількість клітин - кількість мертвих клітин)*100%загальна кількість клітин
Концентрацію клітин для посіву, загальну кількість клітин та кількість забарвлених клітин підраховували за допомогою камери Горяєва [1].
Дію трипсину інгібували додаванням до отриманої клітинної суспензії інактивованої фетальної сироватки теляти із розрахунку 1 об'єм сироватки : 3 об'єма суспензії [1, 48].
Отриману суспензію, концентрація якої складала 4 - 5 *105 клітин/мл [1, 6], розміщували у чашки Петрі та у культуральні планшети з середовищем для культивування. Культивування проводили в умовах 370С та 5% СО2 в атмосфері [53].
Матеріал, дезагрегований механічним та хімічним способами, культивували у середовищі ДМЕМ + 3,7 мг/мл NaHCO3 + 10% FCS + 10 мкл/мл гентаміцину [53], а також у даному середовищі з додаванням 1 мг/мл г