РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкт досліджень
Об’єктом досліджень є функціонування сульфатвідновлювальних бактерій у водоймах
сірковидобувних регіонів.
2.2. Виділення сульфатвідновлювальних бактерій
Для виділення сульфатвідновлювальних бактерій з водної товщі та мулу відбирали
проби методом Столбунова-Рябова [187] на глибині 30 м та 40 м, розводили і
вносили на чашки Петрі з розрахунку 100-150 колоній на чашку. Культури
вирощували протягом 14 днів при 280С в анаеростатах Genbox jars. Для поглинання
кисню використовували генератори GENbox anaer (Франція). Для виявлення колоній
сульфатвідновлювальних бактерій у середовище додавали залізо у формі солі Мора.
Це сприяло утворенню у клітинах бактерій сульфіду заліза і наданню колоніям
чорного кольору. Для виділення чистих культур проводили багатократні розсіви
окремих колоній. Чистоту виділених культур конролювали мікроскопічно.
2.3. Середовища та умови культивування
Складність культивування сульфатвідновлювальних бактерій полягає у забезпеченні
анаеробіозу у посівних середовищах. Анаеробні умови досягаються кип’ятінням і
швидким охолодженням середовищ, що сприяє вивільненню з нього розчинного кисню,
а також додаванням відновників – аскорбінової чи тіогліколевої кислот (1 г/л)
[188].
Для виділення сульфатвідновлювальних бактерій використовували середовище
Кравцова-Сорокіна такого складу (г/л): натрій сульфат - 0,5; натрій
дигідрофосфат - 0,3; калій гідрофосфат - 0,5; амоній сульфат - 0,2; магній
сульфат - 0,1; натрій лактат - 2,0; агар - 16, вода водопровідна - 50 мл; суміш
мікроелементів – 1 мл; вода дистильована - до 1 л, рН середовища - 7,8-8,0
[189].
Розчин мікроелементів готували окремо. Він мав такий склад [79] (мг/л):
FeCl2·4H2O – 210;
MnCl2·4H2O – 100;
CoCl2·6H2O – 170;
ZnCl2 – 100;
CuCl2 – 20;
H3BO3 – 10;
Na2MoO4 – 10;
Na2SeO3 – 17;
NiCl2·2H2O – 28.
Перед посівом зразків до середовища додавали розчин солі Мора у розрахунку 1
г/л та розчин Na2S. Їх стерилізували окремо.
При вивченні здатності бактерій використовувати різні джерела карбону їх
вирощували у середовищі Постгейта В [8] (контролем служило середовище з натрій
лактатом) такого складу (г/л): калій дигідрофосфат – 0,5; амоній хлорид – 1,0;
кальцій сульфат дигідрат – 1,0; магній сульфат гептагідрат – 2,0; джерело
карбону – еквівалентно за масою карбону до 3,5 г/л натрій лактату; дріжджовий
екстракт – 1,0; ферум сульфат гептагідрат – 0,5; кислота аскорбінова – 1,0.
У випадку дослідження активності ферментів бактерії вирощували у середовищі
Постгейта С такого складу (г/л): калій дигідрофосфат – 0,5; амоній хлорид –
1,0; натрій сульфат – 4,5; кальцій хлорид гексагідрат – 0,06; магній сульфат
гептагідрат – 0,06; натрій лактат – 6; дріжджовий екстракт – 1; ферум сульфат
гептагідрат – 0,004; натрій цитрат дигідрат – 0,3: рН середовища – 7,6 [8].
При культивуванні сульфатвідновлювальних бактерій на твердому середовищі
Кравцова-Сорокіна до нього додавали агар в кількості 20 г/л. Колонії виявляли
за їх чорним забарвленням.
Для створення анаеробних умов культивування сульфатвідновлювальних бактерій
здійснювали у пробірках об’ємом 25 мл так, щоб у пробірках не залишалося
повітря. Рідкі середовища засівали густою суспензією бактерій у розрахунку не
менше 2-3 мг клітин на 1 л середовища [188].
Виділені культури зберігали при 4єС у напіврідкому середовищі
Кравцова-Сорокіна, що містило 0,8% агару.
2.4. Дослідження хімічного складу водойм
Визначення складових води проводили наступними методами: Cl- -
меркурієметричним з використанням як індикатора дифенілкарбазону [190]; SO42-,
HCO3- - фотометрично (ФЕК КФК-2) [190, 191]; K+ і Na+ - полум’яно-емісійною
спектрофотометрією (СФ Flahho 4 Carl Zeiss, Jena) [190]; Ca2+ та Mg2+ -
титруванням з трилоном Б [190]; Feзаг - фотометирично з О-фенантроліном [190].
Концентрацію іонів водню у пробі визначали за допомогою pH-метра МТ-58.
2.5. Фотоелектроколориметричний метод визначення концентрації клітин
Біомасу визначали за мутністю суспензії клітин шляхом її фотометрування на
фотоелектроколориметрі КФК –3 (л=340 нм, кювета з оптичним шляхом 3 мм).
Формула розрахунку:
С, мг/мл = (Е340·n)/0,19, (2.1)
де Е340 – екстинкція при 340 нм, n – розведення, кількість разів, 0,19 –
коефіцієнт перерахунку, обчислений ваговим методом.
2.6. Визначення здатності клітин до спороутворення
Для дослідження здатності бактерій утворювати спори використовували метод
фарбування за Пєшковим [192] суспензію клітин, вирощених у середовищі
Кравцова-Сорокіна, прогрівали на водяній бані при 80°С протягом 10 хв. Після
цього їх висівали на чашки Петрі та інкубували протягом 14 діб. Поява колоній
на чашках свідчила про здатність культур утворювати спори.
2.7. Вивчення здатності бактерій до хемолітогетеротрофного росту
У колби об’ємом 50 мл наливали 20 мл середовища Кравцова-Сорокіна, що не
містило солі Мора і натрій сульфіду. Замість натрій лактату вносили таку ж
кількість натрій ацетату і додатково 50 мл/л 10% розчину натрій гідрокарбонату
як джерела вуглекислого газу і додавали 0,6 мл суспензії клітин. Колби поміщали
в анаеростат, який наповнювали воднем. Наповнений воднем анаеростат поміщали в
термостат на 14 діб.
Водень одержували, використовуючи електролізер за загальноприйнятим методом
[193]. Для електролізу через 30 % розчин натрій гідроксиду пропускали
електричний струм силою 3А.
2.8. Виявлення десульфовіридину
Десульфовіридин в клітинах визначали за методом Постгейта [176], використовуючи
спектрофотометр SPEKOL 11 з флуорометричною приставкою FK. Вирощені в рідкому
середовищі клітини виділених культур центрифугували при 8000 об/хв. протягом 20
хв. Клі
- Київ+380960830922