РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи досліджень
2.1. Об’єкт досліджень
Об’єктом досліджень був позаклітинний фермент a-L-рамнозидаза
(б-L-рамнозид-рамногідролаза – КФ 3.2.1.40) Penicillium commune Thom (syn.
Penicillium palitans Westling) 266, одержаний в результаті скринінгу із
колекції мікроорганізмів відділу фізіології і систематики мікроміцетів ІМВ НАН
України. Культуру було ізольовано з шампіньйонних компостів.
Штам зберігали на твердому живильному середовищі (сусло-агар) при температурі
+4°С з періодичними пересівами 1 раз на рік.
2.2. Скринінг продуцентів б-L-рамнозидази
Скринінг проводили серед штамів грибів та бактерій, одержаних з музею живих
культур, які були надані співробітниками відділів антибіотиків (к.б.н., с.н.с.
Л.А. Сафроновою) і фізіології та систематики мікроміцетів (д.б.н., проф.
Н.М. Ждановою, к.б.н., с.н.с. О.В. Соколовою, м.н.с. О.С. Харкевич,) ІМВ НАН
України, за що ми їм щиро вдячні.
Штами мікроміцетів та бактерій культивували глибинним способом в пробірках на
качалках: зі швидкістю обертання 220 об/ хв при температурі 26-28 оС впродовж 5
діб на модифікованому рідкому поживному середовищі Чапека (г/л): KH2PO4 - 1,0;
NaNO3 - 2,0; KCl - 0,5; MgSO4 ґ7H2O - 0,5; FeSO4ґ7H2O - 0,015; нарингін - 5;
Н2О; pH 5,2 (мікроміцети) [24, 44, 114]; при температурі 36 оС впродовж 2 діб,
на рідкому живильному середовищі наступного складу (г/л): нарингін – 5; KH2PO4
- 3,0; MgSO4 ґ7H2O – 2,0; (NH4)2SO4 – 6,0; СаСО3 – 3,0; дріжджовий автолізат –
0,5; Н2О; рН – 7,0-7,2 (бактерії) [1, 6].
Після ферментації біомасу грибів відділяли фільтруванням, а бактерій -
центрифугуванням у при 5000Чg, впродовж 30 хв [38], і в культуральних
фільтратах визначали a-L-рамнозидазну активність, використовуючи природний
субстрат – нарингін (метод Davis, див. далі) та інші глікозидазні активності.
Як синтетичні субстрати застосовували та n-нітрофенільні похідні відповідних
глікозидів.
2.3. Способи культивування
Посівний матеріал культури P. commune 266 вирощували на синтетичному середовищі
Чапека наступного складу (г/л): KH2PO4 - 1,0; NaNO3 - 2,0; KCl - 0,5; MgSO4
ґ7H2O - 0,5; FeSO4ґ7H2O - 0,015; нарингін - 5; Н2О; pH 5,2.
Середовище засівали шматочком міцелію гриба, вирощеного на сусло-агарі.
Вирощування посівного матеріалу P. commune 266 здійснювали глибинним способом
на колбах при температурі +28 оС протягом 48 год на качалці при 220 об/хв.
Посівний матеріал P. commune 266 вносили із розрахунку відповідно 10% до об’єму
середовища в колби Ерленмейера ємністю 0,5 л, які містили по 100 мл середовища
того ж складу. Ферментацію вели в тих же умовах, що і отримання інокулюму, але
впродовж 120 год.
2.4. Оптимізація поживного середовища і умов культивування
Оптимізацію поживного середовища та умов культивування здійснювали поетапно за
допомогою методів математичного планування експериментів: відсіювального
експерименту, дробового факторного експерименту, методу стрімкого сходження та
повного факторного експерименту. Оцінку однорідності результатів експериментів
проводили за критерієм Кохрена, оцінку адекватності апроксимаційної моделі
дослідних даних - за критерієм Фішера, оцінку значущості коефіцієнтів моделі -
за допомогою критерію Стьюдента [10, 32, 34, 37, 46].
Вирощування грибної культури проводили в глибинних умовах в колбах Ерленмейєра
(0,5 л) на качалках при 160 та 220 об/хв, або в пробірках, при температурі 26
оС протягом 4-5 діб, якщо не оговорено окремо. Посівним матеріалом слугував
двох-трьохдобовий вегетативний міцелій, який вирощували на рідкому поживному
середовищі (контроль) такого складу (г/л): нарингін (або рамноза якщо це
оговорено) - 5; NaNO3 - 2,0; KH2PO4 - 1,0; MgSO4ґ7Н2О- 0,5; KCl - 0,5;
FeSO4ґ7Н2О - 0,015; Н2О ; рН 5,0.
Як джерела вуглецю використовували: рамнозу, глюкозу, галактозу, манозу,
сорбозу, арабінозу, ксилозу, лактозу, мальтозу, трегалозу, цукрозу, рафінозу,
інозит, маніт, сорбіт, нарингін, кверцитин, кукурудзяне борошно, соєве борошно
(в концентрації 5 г/л).
При вивченні впливу джерела азоту на біосинтез глікозидази в середовище вводили
NaNO3, NaNO2, (NH4)2SO4, (NH4)2NO3, пептон, сечовину, сечовина:(NH4)2SO4 (у
співвідношенні 2:3). Неорганичні джерела азоту вносили в концентрації 1,5 г/л,
пептон, сечовину - 5 г/л [7].
Результати дослідів оцінювали за активністю б-L-рамнозидази, яку визначали в
культуральній рідині, як описано вище, використовуючи як субстрат
п-нітрофеніл-б-L-рамнопіранозид.
Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента
для малих вибірок на 5% рівні значимості. Досліди проводили в трьох
повторностях. В таблицях наведено середні арифметичні значення.
Умови культивування оптимізували на середовищі, що було адаптоване за джерелами
вуглецю та азоту. Вплив рН на біосинтез ферментів вивчали, вирощуючи культуру
продуцента при вихідних значеннях рН середовища 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0. З
метою виявлення оптимальних умов біосинтезу, культуру P. commune 266 вирощували
у колбах з об’ємом поживного середовища 50, 100, 150, 200 мл, при обертах
качалки 160, 220, 240 об/хв., температурі 25, 28 та 32оС. Посівний матеріал
вносили у концентрації 5, 10 та 20 % від об’єму середовища [46].
2.5. Визначення біомаси
Біомасу визначали ваговим методом після її відокремлення від культуральної
рідини, промиванням дистильованою водою та висушуванням до постійної маси при
105 °С [36].
2.6. Методи виділення та очистки препаратів a-L-рамнозидази
Для отримання препаратів ферментів мікроміцети вирощували глибинним способом на
середовищі Чапека в 0,5-літрових колбах Ерленмейєра при 28 0С на качалці зі
швидкістю обертання 220 об/хв протягом 120 год.
Ферментний препарат a-L-рамнозидази
- Київ+380960830922