Розділ 2
Матеріали і методи досліджень
Об’єктом дослідження був ліофілізований промисловий субалін препарат,
виготовлений на ВАТ "Дніпрофарм".
Виділення патогенних серотипів кишкової палички проводили від хворих на
колібактеріоз курей, у яких інфекція проявлялась в респіраторній (38 особин),
кишковій (23 птиці) формі, омфаліту (8 голів), а також у вигляді сальпінгіту та
синовіїту (по 5 курей) – всього 79 особин. Матеріалом дослідження були:
виділення курей - при респіраторній формі, сироподібні маси яйцеводів - при
сальпінгіті, патологічно змінені тканини зв’язок - при синовіїті, рідина з
пупкового канальця - при омфаліті, фекалії - від курей з кишковою формою
колібактеріозу. Бактеримія, яка супроводжує різні форми цієї хвороби, зумовила
використання крові, шматочків серця, печінки, селезінки як джерел виділення
збудника.
Ідентифікацію E. colі проводили за комплексом морфологічних, культуральних,
тинкторіальних та біохімічних властивостей згідно схеми, вказаної в роботі та
настанови з лабораторної діагностики ешеріхіозу (колібактеріозу) тварин [76,
133].
Серологічне типування ізольованих штамів E.coli проводили реакції аглютинації
на склі з використанням О-колібактеріальних сироваток і суспензії однодобової
досліджуваної культури, прогрітої на водяній бані при 1000 С.
Сироватки до культур типового штаму E. coli V5/41, а також до штамів кишкової
палички з соматичним антигеном О1 – E. coli 1р та E. coli 2p, виділених від
хворих курей, отримували, імунізуючи кроликів 2-х мільярдною грітою культурою
за схемою внутрішньовенного введення 0,5 мл – 1,0 мл – 1,5 мл – 2,0 мл – 2,0 мл
з інтервалом 3–5 днів.
Реакцію виснаження сироваток за Кастелані ставили на холоді при 40 С з періодом
інкубації реакційної суміші, що складалась із специфічної сироватки і суспензії
грітого корпускулярного антигену протягом 12 годин.
Визначення ферментів патогенності. Наявність у культур гемолізину перевіряли
посівом досліджуваних мікробів на кров’яний агар. Навколо колоній
спостерігались зони просвітлення.
Для визначення присутності гіалуронідази в пробірку з досліджуваною культурою
вносили гіалуронову кислоту і після 30-хвилинної експозиції при 370 С додавали
2 краплі концентрованої оцтової кислоти. При наявності ферменту гіалуронова
кислота втрачала здатність утворювати згусток.
Кератокон’юнктивальну пробу відтворювали на морських свинках, закрапуючи 2-х
мільярдну суспензію живих ешеріхій за нижнє віко.
Патогенність виділених кишкових паличок перевіряли біологічною пробою на білих
мишах масою 14 – 16 г, вводячи інтраперитонеально суспензію агарової культури у
фізіологічному розчині в дозі 500 млн. мікробних клітин (за оптичним стандартом
мутності). Загибель тварин відмічали протягом трьох діб.
Визначення антагоністичної активності. Як тест-мікроби для визначення
антагоністичної активності субаліну в дослідах in vitro використовували 62
свіжовиділених штами ентеропатогенних кишкових паличок (з них по вісім -
серотипу О2 та О55, по 5 штамів серотипу О1, О111 та О117, по 2 – серотипу О6,
О103, три штами – О101, по одному штаму О115 і О124 та 16 штамів серотипу О78)
і 5 штамів типових культур E.coli (по одному штаму серотипів О1, О2, О55, О78
та О124).
Антагоністичну активність субаліну перевіряли методом відстроченого антагонізму
на поверхні середовища Гаузе – 2 [45].
Встановлення інфікуючої дози. Експериментальну колібактеріальну інфекцію
відтворювали на курях породи Домінант шляхом перорального введення суспензії
патогенного для птиці штаму E.coli О78 в дозі 1,5 млрд. мікробних клітин на кг
ваги.
Для вивчення впливу величини інфікуючої дози E. coli О78 на форму протікання
колібактеріозу використали по 60 курей віком 32, 120 і 350 днів, всього 180
голів.
Визначення профілактичної та лікувальної дози субаліну. Профілактичну дію
субаліну при колібактерільній інфекції перевіряли на 80-ти курях віком 350
днів. Контрольна група складала 20 особин, всього 100 курей.
Терапевтичний ефект пробіотика у курей, інфікованих колібактеріозом, перевіряли
на 154 особинах.
В якості досліджуваних служили групи здорових курей у віці 350 днів: інтактні і
піддослідні (що отримували субалін), а також групи особин з експериментальним
колібактеріозом і реконвалесценти, лікування в одній з яких проводили
субаліном, а в іншій - норфлоксацином. В кожній групі було по 20 особин, всього
80 голів.
Субалін, добова доза якого складала 150 млн. мікробних клітин, застосовували
для лікування хворих на колібактеріоз курей курсом з десяти днів.
Норфлоксацин як терапевтичний препарат вводили з розрахунку 20 мкг на кг ваги.
Забір крові в цих групах проводили з підкрильцевої вени.
Визначення мікробіоценозу кишечника проводили у відповідності з методичними
рекомендаціями [36]. Мікрофлору виділяли на наступних середовищах:
біфідобактерії – на Блаурока, лактобактерії – на МРС – 1(Man I., Rogosa M.,
Sharpe M.), кишкові палички – на середовищі Ендо, ентерококи – на
ентерококовому диференціально-діагностичному середовищі (ЕДДС), стафілококи –
на середовищі Чистовича, бактерії роду Proteus – на МПА за методом Шукевича,
дріжджоподібні гриби роду Candida – на середовищі Сабуро. Оцінку гемолітичної
активності виділених кишкових паличок, ентерококів та стафілококів проводили на
5% кров’яному агарі.
Визначення рівня середньомолекулярних пептидів. Рівень пептидів середньої
молекулярної маси (СМП) вимірювали фотометричним методом при 254 нм після
попереднього освітлення сироватки 10%-ним розчином трихлороцтової кислоти.
Рівень СМП виражали в одиницях, що кількісно відповідають показникам екстинції.
За норму приймалась величина, рівна 0,240 од. [33].
Визначення рівня активності лізоциму
- Київ+380960830922