РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ Й ОБ’ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Відбір тварин для дослідження
Досліди проведено на білих безпородних щурах-самцях масою 120-160 г, яких
утримували на стандартному раціоні віварію. У процесі роботи було використано
168 тварин.
Моделями токсичного ураження тварин слугували інтоксикація нітритом натрію,
комбінована інтоксикація хлоридом кадмію та нітритом натрію, а також поєднана
дія СdCI2 та NaNO2 на тлі рентгенівського опромінення. При вивченні токсичної
дії нітриту натрію, його вводили протягом 5 діб через день внутрішньошлунково в
дозі 150 мг/кг маси тіла. За поєднаної та комбінованої дії вищевказаних
токсикантів нітрит натрію вводили в дозі 70 мг/кг (1/3 LD50). Хлорид кадмію
вводили внутрішньошлунково в дозі 6 мг/кг маси тіла ( 1/15 LD50) протягом 5 діб
через день внутрішньошлунково. Одноразове опромінювання проводили за допомогою
рентгенівського апарата РУМ-17 у дозі 1 Гр (напруга - 40 кВ, сила струму - 80
мА, фільтри - 0,5 мм Сu та Zn, шкірно-фокусна відстань 40 см, потужність дози -
1 Р/с). Щурів поміщали в дерев’яні клітки по 7 тварин у кожній серії досліду,
що давало можливість опромінювати всіх щурів після розташування їх на фокусній
відстані від рентгенапарата [43] .
Тварин декапітували під легким ефірним наркозом на 1-шу, 3-тю та 5-ту доби від
моменту інтоксикації.
Дослідження проводили у гомогенаті печінки та сироватці крові.
Піддослідних тварин було поділено на такі групи: І – інтактні; ІІ – тварини,
отруєні нітритом натрію; ІІІ – тварини, отруєні нітритом натрію та хлоридом
кадмію; IV – тварини, які одночасно піддавалися поєднаному отруєнню нітритом
натрію та хлоридом кадмію після одноразового опромінення; V - тварини, яким для
корекції поєднаного ураження нітритом натрію та хлоридом кадмію на тлі
рентгенівського опромінення вводили гістидинат міді; VI – тварини, опромінені
та отруєні нітритом натрію і хлоридом кадмію, які отримували L-аргінін; VII –
тварини, опромінені та отруєні СdCI2 та NaNO2, які отримували L-аргінін та
фібрабет.
З метою корекції виявлених порушень внутрішньоочеревинно щоденно під час
отруєння вводили гістидинат міді у вигляді водного розчину в дозі 0,94 мг/кг
(біотичний рівень міді в крові). Металокомплекс синтезований проф. Я.І.
Гонським на кафедрі медичної біохімії з гістидину та гідроксиду міді, які брали
в еквімолярних концентраціях. Ентеросорбент фібрабет - біологічно активну
харчову добавку вводили тваринам внутрішньошлунково у вигляді крохмальної
суспензії у дозі 1 г/кг маси тіла тварин протягом всього експерименту в
комплексі з L-аргініном. L-аргінін вводили щоденно внутрішньоочеревинно у
вигляді водного розчину в дозі 50 мг/кг маси тіла (вміст амінокислоти в
сироватці крові тварин в нормі).
Роботу з щурами проводили згідно з правилами Європейської конвенції про гуманне
ставлення до лабораторних тварин [205].
2.2. Визначення вмісту загального білка в сироватці крові
Білки реагують в лужному середовищі з сірчанокислою міддю із утворенням сполук
фіолетового кольору (біуретова реакція). Інтенсивність забарвлення розчину
прямо пропорційна вмісту білків в сироватці крові [92].
До 0,1 мл плазми крові (або гомогенату печінки) додавали 5 мл біуретового
реактиву, змішували, уникаючи утворення піни. Через 30 хвилин визначали оптичну
щільність проби за допомогою фотоелектроколориметра (кювета з довжиною
оптичного шляху 10 мм) при довжині хвилі 540 нм проти контрольного розчину,
який готували шляхом додавання до 5,0 мл біуретового реактиву 0,1 мл 0,9 %
розчину NaCl.
Розрахунок проводили за за формулою:
С = Ск ґ Ед/Ек (2.1)
де С – концентрація білка, г/л
Ск – концентрація білка в калібрувальному розчині, г/л
Ед – оптична щільність дослідної проби
Ек – оптична щільність калібрувальної проби
2.3. Електрофоретичне розділення білків сироватки крові на агарозі
Метод ґрунтується на різній рухливості білків в електричному полі залежно від
заряду та молекулярної маси білка.
Електрофоретичне розділення проводили на апараті Cormay gel protein 100. У
кожну частину камери наливали по 150 мл вероналового буфера. Обережно виймали
гель із упаковки, не торкаючись до його поверхні і клали на папір. Осушували
місце нанесення проб шляхом швидкого прикладання паперової смужки. Вологий
папір обережно забирали. На підсушенему місці розміщували фольгу для нанесення
проб, легко притискаючи її до основи і розгладжуючи пальцем. Фольга повинна
щільно прилягати до гелю. Відбирали 5 мкл розведеної сироватки крові у кожен
виступ фольги і залишали на 5 хв, відлік вели від моменту нанесення останньої
проби. Надлишок сироватки забирали смужкою паперу. Обережно знімали фольгу.
Згинали пластинку з агарозою і поміщали її в камеру гелем вниз, щоб місця
нанесення сироваток знаходились з боку катода. Закривали камеру кришкою.
Проводили електрофорез 20 хв при напрузі 100 В. Після закінчення електрофорезу
виймали пластинку і занурювали її на 15 хв у фіксаж у вертикальному положенні.
Сушити пластинку слід у сушці при температурі до 80° С. Після цього занурювали
пластинку в барвник на 10 хв і потім знебарвлювали її у 2-3 ванночках.
Знебарвлену пластинку полоскали дистильованою водою і висушували у сушці.
Розшифровували за допомогою денситометра.
2.4. Метод визначення окиснювальної модифікації білків
(2,4-динітро-фенілгідразонів)
У процесі окиснювальної модифікації білків плазми утворюються альдегідні й
кетонні групи, які взаємодіють з 2,4-динітрофенілгідразином з утворенням
2,4-динітрофенілгідразонів, що мають характерний спектр поглинання. Альдегідо-
і кетонопохідні нейтрального характеру реєструються при 370 нм (ОМБ370), а
основного - 430 нм (ОМБ430) [131].
Для
- Київ+380960830922