РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження за темою дисертаційної роботи виконані в 2003-2005 роках у
відповідності з планами науково-дослідних робіт лабораторії живлення свиней
Інституту біології тварин УААН.
Експериментальна частина робіт виконана у трьох серіях дослідів.
Метою першої серії дослідів було вивчити вплив різних форм хрому на окремі
показники обміну ліпідів крові, інтенсивність процесів пероксидного окиснення
ліпідів, стан антиоксидантної системи у еритроцитах крові, стресостійкість та
продуктивність поросят. Для цього було підібрано три групи поросят (по 10-12
голів у кожній), аналогів за живою масою, в період відлучення їх від свиноматок
у 45-денному віці, що належали свинофермі ТзОВ “Малі Ланки” Перемишлянського
району, Львівської області. Тваринам контрольної та обох дослідних груп
згодовували основний раціон концентратного типу, що використовувався в даному
господарстві. За три та за дві доби до відлучення поросятам контрольної групи
вводили внутрішньом’язово по 1 мл фізіологічного розчину. Тваринам першої
дослідної групи дворазово (за три та за дві доби до відлучення)
внутрішньом’язово вводили по 1 мл CrCl3 (в 1 мл фізіологічного розчину
міститься 150 мкг чистого хрому), а поросятам другої дослідної групи також
дворазово (за три та за дві доби до відлучення) внутрішньо задавали по 1 болюсу
з Cr-метіоніном (в 1 болюсі міститься 150 мкг чистого хрому).
Друга і третя серія дослідів проведена за аналогічною схемою першої серії
досліджень, на поросятах великої білої породи, які належали господарству
“Нагорянка” Пустомитівського району Львівської області. Метою другої серії
досліджень було вивчити біологічну дію неорганічної та органічної сполук хрому
на концентрацію інсуліну, кортизолу, тироксину, трийодтироніну, окремі
показники обміну білків та вуглеводів у крові, збереженість та продуктивність
поросят. У третій серії досліджень вивчали стан антиоксидантної системи захисту
та пероксидне окиснення ліпідів у лімфоцитах та нейтрофільних гранулоцитах
крові поросят за дії різних форм хрому.
Поросята мали вільний доступ до комбікорму і води. Кількість спожитого
комбікорму визначали за його залишком у годівниці. При відлученні поросят від
свиноматок у 45-ти денному віці визначали їх живу масу. Контроль за ростом і
розвитком поросят проводили шляхом зважування їх на початку та в кінці
дослідів.
Матеріалом для біохімічних досліджень служили зразки крові, одержаної з
передньої порожнистої вени, як антикоагулянт використовували гепарин.
Зразки крові одержували до ранкової або вечірньої годівлі [67] на 40-, 45-,
50-, 55- і 70-й денний вік поросят. Для одержання плазми кров центрифугували
при 3000 об/хв протягом 10 хв. Еритроцити 4-5 разів відмивали 0,15 М розчином
NаС1 на 5 мМ фосфатному буфері (рН - 7,4) при t° 2-4°С шляхом центрифугування
протягом 10 хв. при 5000 об/хв. Зразки плазми крові до проведень досліджень
зберігали в рідкому азоті.
Виділення нейтрофільних гранулоцитів і лімфоцитів крові проводили в градієнті
густини фікол-верографіну [67]. До гепаринізованої крові додавали 10 % розчин
желатину (на 9 мл крові 1 мл желатину), відстоюється на водяній бані (37°С)
15-30 хв.
Вносили у пробірки суміш фікол-верографіну (по 2 мл) з густинами: 1,119 і
1,077. Нашаровували плазму з лейкоцитами 1 мл. Після центрифугування протягом
15 хв. при 3000 об/хв на горизонтальному роторі, отримували: І шар –
(лімфоцити, моноцити і кров’яні пластинки) на межі між плазмою і густиною
1,077. ІІ шар – ( гранулоцити і еритроцити) на межі між густинами 1,077 і
1,119.
Після відбирання цих двох шарів у окремі пробірки: до І шару, для позбавлення
від кров'яних пластинок, додавали 2-кратний об’єм 0,02% ЕДТА і центрифугували
при 3000 об/хв 5 хв.; до ІІ шару додавали 0,2% NaCl (для гемолізу еритроцитів)
і центрифугували при 3000 об/хв 5 хв. (об’єм 10-кратний порівняно з об’ємом ІІ
шару).
Лізис клітин проводили шляхом замороження і відтаювання.
У плазмі крові визначали концентрацію інсуліну, кортизолу, тироксину,
трийодтироніну, глюкози, сечовини, загального білка та співвідношення його
окремих фракцій, гідроперекисей ліпідів, малонового діальдегіду, вміст
загальних ліпідів та співвідношення окремих їх класів, активність
аланінамінотрансферази і аспартатамінотрансферази.
В гемолізаті еритроцитів та лізаті лімфоцитів і нейтрофільних гранулоцитів
визначали активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, ферментів
супероксиддисмутази, глутатіонредуктази, глутатіонпероксидази і каталази, вміст
відновленого глутатіону, гідроперекисів ліпідів та малонового діальдегіду.
2.1. Визначення концентрації глюкози в плазмі крові
Концентрацію глюкози визначали глюкозооксидазним методом за допомогою наборів
фірми "Біомарк". Принцип методу: при окисленні глюкози глюкозооксидозою
утворюється Н2О2, який у присутності пероксидази окислює о-діанізидин,
перетворюючи його у сполуку, забарвлену в синій колір. Хід визначення:
досліджувану рідину (0,02 мл. плазми крові, або екстракту тканини) переносили у
пробірки, які містять 4,5 мл пероксидазного буферу та 0,5 мл глюкозооксидазного
реактиву, ставили на 30 хв. у водяну баню при температурі 37° С і після
охолодження проб додавали 1,5 мл. 50% Н2SО4. Інтенсивність забарвлення
визначали фотометричне при 530 нанометрах. Кількість глюкози вираховували за
формулою: Х=Е х 320, де:
Е - оптична щільність досліджуваної проби.
2.2. Визначення концентрації загального білка в плазмі крові
Концентрацію загального білка в плазмі крові визначали за методом Лоурі [101],
за допомогою набору фірми “SІМКО Ltd”. Метод базується на утво
- Київ+380960830922