РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти дослiджень та умови проведення експериментів
Експеpименти пpоводили на статевозpілих безпоpодних білих щуpах-самцях, масою
240-260 г, яких утpимували в умовах віваpію. Піддослідних тваpин тестували на
резистентність до гіпоксичної гіпоксії згідно рекомендацій В.Я. Березовського
[7]. Серед інтактних тварин можна виділити особин, які володіють високою і
низькою природною резитстентністю до дефіциту кисню. Розподіл інтактних щурів
на низько- і високорезистентних до летальної гіпоксії проводили шляхом
індивідуальинх випробувань під вакуумним ковпаком на “висоті” 12000 м з
“підйомом” протягом 1 хв. Другий агональний вдих у високорезистентних до
гіпоксії щурів наставав через 180-300 с, у низькорезистентних – через 60-100 с.
У дослід тварин брали через 14 днів після тесту.
Експерименти проводили на щурах, низькорезистентних до гіпоксичної гіпоксії.
Тварин ділили на 6 гpуп:
контрольні тваpини; яким вводили внутрішньоочеревинно фізіологічний pозчин
об’ємом 0.4 мл,
тваpини, яким вводили внутрішньоочеревинно водний pозчин каpнозину, об’ємом 0.4
мл, в дозі 20 мг/кг маси тіла щура [30, 98];
тварини, яким вводили внутрішньоочеревинно водний pозчин Zn2+-каpнозину,
об’ємом 0.4 мл, в дозі 10 мг/кг маси тіла щура (Zn2+-каpнозин у такій дозі
виявляє терапевтичний ефект, наприклад, при застосуванні його для лікування
виразкової хвороби шлунка [246]);.
тварини, яких піддавали дії гіпоксичної гіпобаричної гіпоксії протягом 30 хв;
тваpини, яким за 30 хвилин до гіпоксичної гіпобаричної гіпоксії вводили
внутрішньоочеревинно водний pозчин каpнозину, об’ємом 0.4 мл, в дозі 20 мг/кг
маси тіла щура;
тваpини, яким за 30 хвилин до гіпоксичної гіпобаричної гіпоксії вводили
внутрішньоочеревинно водний pозчин Zn-каpнозину, об’ємом 0.4 мл, в дозі 20
мг/кг маси тіла щура;
Гостру гіпоксичну гіпобаричну гіпоксію моделювали в проточній барокамері, де
протягом 30 хв створювали умови розрідженого атмосферного повітря (170 мм рт.
ст.), що відповідає висоті 11 000 м над рівнем моря [52].
Тварин забивали декапітацією. Головний мозок видаляли, відпрепаровували нюхові
цибулини за Glowinski and Iversen [167], очищали їх від арахноїдальної
оболонки, промивали у льодяному 20 mМ ТRIS-HCl буфері (pH 7.4) з 2 mM EDTA і
заморожували в рідкому азоті.
Периферичну кров гепаринізували (50 од. мл). Плазму крові відбирали після
центрифугування цільної крові при 3000 g, 5 хв.
В експериментах in vitro використали кристалічний препарат гемоглобіну бика
(“Reanal”, Угорщина).
Використано ліофільний препарат карнозину, отриманий із м’ясного екстракту
виробництва Санкт-Петербурзького м’ясокомбінату (Росія), оскільки
експериментально доведено, що карнозин природного, а не синтетичного походження
володіє антиоксидантними властивостями [13].
Препарат Zn2+-карнозин синтезований у Дніпропетровському університеті і
люб’язно наданий доц. Зегждою Г. Д.
Досліджено, що при внутрішньочеревинному введенні щурам карнозину у дозі 20
мг/кг приріст дипептиду у головному мозку досягає максимального значення через
півгодини і становить 25%, для крові ця величина становить 60% через 15 хвилин
після введення [30]. Після внутрішньоочеревинної ін’єкції карнозину частина
введеної дози дипептиду з током кроів потрапляє у внутрішні органи, а решта
може долати ГЕБ і досягати різних відділів головного мозку за допомогою
протон-залежного пептид/гістидинового переносника PHT1 [162]. Виявлені сайти
зв’язування карнозину з мембранами нюхових цибулин [333].
Варіаційно-статистичну обробку одержаних результатів проводили, використовуючи
критерій Ст’юдента, за допомогою комп’ютерної програми Origin.
2.2. Дослідження стійкості щурів до гострої гіпобаричної гіпоксії
Виживання тварин в умовах барокамери проводили згідно рекомендацій Л.Д.
Лук’янової [52]. Щурам за 30 хв до гіпоксії вводили внутрішньоочеревинно водні
розчини карнозину та Zn2+-карнозину. Тварин витримували у проточній барокамері,
де створювали атмосферний тиск 145 мм рт. ст., що відповідає висоті 11 500 м
над рівнем моря. У піддослідних тварин реєєстрували такі параметри:
час втрати пози, с - період від початку підйому в барокамері до моменту, коли
тварина приймає бокове положення і втрачає здатність підтримувати позу;
час до зупинки дихання, с – період від початку підйому в барокамері до моменту,
коли тварина тимчасово припиняє дихання;
час відновлення пози, с - період часу від зупинки дихання до того моменту, коли
тварина при швидкому “спуску” на землю знову набуває здатності стояти на
кінцівках.
2.3. Методи визначення метаболітів у тканинах
У нюхових цибулинах і крові піддослідних щурів визначали концентрації
метаболітів гліколізу – молочної та піровиноградної кислот з використанням
ензиматичних методів; метаболітів оксиду азоту – нітрит- і нітрат-іонів
спектрофотометрично. Проведено дослідження вмісту вільних амінокислот у нюхових
цибулинах головного мозку.
2.3.1. Депротеїнізація тканин для визначення вмісту піровиноградної і молочної
кислот [62]. Осадження білків в екстракті нюхових цибулин головного мозку та
плазмі крові проводили 0.6 н. розчином НСlO4 з подальшим видаленням осаджених
білків центрифугуванням (5000 g, 15 хв, 4?С). Нейтралізацію безбілкового
екстракту тканин проводили 5М розчином К2СО3.
2.3.2. Кількісне визначення піровиноградної та молочної кислот у тканинах
ензиматичним методом. В основу кількісного визначення піровиноградної кислоти у
тканинах та біологічних рідинах покладено метод Цока і Лампрехта [150], а
молочної кислоти – метод Хохорста [181] з модифікаціями Єщенко Н.Д. (1982).
Методи визначення вмісту молочної і піровиноградної кисло
- Київ+380960830922