РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкт досліджень
Клітини лінії MCF-7 аденокарциноми молочної залози людини, що відрізняються
чутливістю до доксорубіцину – чутливі (MCF-7 (wt)) та стійкі (MCF-7 (DOX/R)),
були отримані з колекції клітинних культур Інституту онкології (Глівіце,
Польща). Клітини вирощували в середовищі Ігла, модифікованому Дальбекко (DMEM,
“Sigma”, США), за присутності 10% декомплементованої ембріональної сироватки
великої рогатої худоби (FCS, “Sigma”, США) і 50 мкг/мл гентаміцину (“Sigma”,
США). Культивовані клітини підтримували в зволоженій атмосфері з 5% СО2 при
37єС. Пересів клітин здійснювали кожні 2-3 доби розведенням клітинної суспензії
у співвідношенні 1:3.
В окремих дослідах додатково використано клітини наступних ліній: CCL-64
(клітини епітелію легені норки), отримані з колекції клітинних культур
Людвігівського Інституту ракових досліджень (Уппcала, Швеція); L1210 та L1210/R
(клітини лейкемії миші, чутливі та стійкі до дії цисплатину, відповідно),
Jurkat T клітини (лейкемія людини) – з колекції клітин Інституту
експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького
(Київ, Україна); К562 (еритролейкемія людини) – з колекції клітинних культур
Інституту цитології РАН (Санкт-Петербург, Російська Федерація).
2.2. Опромінення клітин
Клітини висівали в 25-см2 культуральні флакони. Через 24 год після висіву,
клітини синхронізували, спочатку двічі промиваючи їх безсироватковим
культуральним середовищем, а потім інкубуючи їх протягом 24 год у
безсироватковому DMЕМ, яке містило 0,2% бичачого сироваткового альбуміну (BSA,
“Sigma”, США). Клітини опромінювали дозами 1,5–4,5 Гр на рентгенівській
установці РУМ-17 (СРСР), при напрузі 130 кВ, силі струму 10 мА та відстані 40
см від джерела радіації до поверхні культурального флакона. Потужність дози
становила 0,75 Гр/хв. Опромінення проводили при кімнатній температурі. Після
закінчення опромінення, культуральне середовище у флаконах з клітинами
замінювали на свіже DMEM з додаванням 10% FCS.
У дослідах, де вивчали вплив іонізуючої радіації на пошкодження ДНК та
репарацію цих пошкоджень, опромінення (2,0 Гр) досліджуваних клітин проводили
на льоді. На даному етапі досліджень було використано рентгенівську установку
Clinac 600 (“Varian”, США). Потужність дози становила 1 Гр/хв.
2.3. Обробка клітин хіміопрепаратами
Для оцінки впливу протипухлинних препаратів на досліджувані культури, клітини
(попередньо синхронізовані) інкубували протягом 24 год за наявності в
культуральному середовищі (DМЕМ+10% FCS) одного з протипухлинних препаратів:
доксорубіцину, цисплатину (“Ebewe”, Австрія) чи метотрексату (“Leberle”, США).
Ефективні концентрації препаратів підбирали так, щоб через 24 год інкубації із
препаратом кількість живих клітин зменшувалась на 50% порівняно з контролем.
2.4. Визначення кількості та життєздатності клітин
2.4.1. Цитометрія клітинної суспензії. Інтенсивність росту клітинної культури
оцінювали, підраховуючи кількість клітин у цитометричній камері
Фукса-Розенталя. Для підрахунку використовували як від’єднані, так і
прикріплені до поверхні культурального флакона клітини. Останні знімали з
поверхні флакона розчином 0,25% трипсину (“Difco’’, США) – 1мМ версену
(“Sigma”, США), приготовленому на забуференому фізрозчині. Концентрацію
клітинної суспензії визначали за формулою: С = nЧ5000, де С – концентрація
(кількість клітин у 1 мл суспензії), n – середня кількість клітин у 4-х великих
квадратах камери Фукса-Розенталя.
Цитостатичний ефект дії генотоксичного чинника визначали за формулою:
(Nдос/Nконтр)Ч100%, де Nдос – загальна кількість клітин у дослідному зразку,
Nконтр – загальна кількість клітин у контрольному зразку.
2.4.2. Оцінка цитотоксичної дії досліджуваних чинників. Принцип методу
базується на тому факті, що живі клітини володіють вибірковою проникністю
плазматичної мембрани для різних речовин і, зокрема, вони непроникні для
барвника трипанового синього.
Відсоток мертвих клітин визначали після їх фарбування розчином трипанового
синього (кінцева концентрація 0,1%, час фарбування – 5 хв) та підрахунку
зафарбованих і незафарбованих клітин під інвертованим мікроскопом Біолам-Р
(“ЛОМО”, Російська Федерація).
2.5. Морфологічне дослідження клітин
2.5.1. Прижиттєве фарбування клітин барвником акридиновим оранжевим. Зміни у
морфології клітин MCF-7(wt) та MCF-7(DOX/R) під впливом іонізуючого опромінення
оцінювали, шляхом прижиттєвого фарбування флюорохромним барвником акридиновим
оранжевим (3,6-диметиламіноакридин) (“Sigma”, США) [62]. Клітини вирощували у
пластикових 40-мм чашках Петрі, опромінювали, як описано вище (п. 2.2.), та
інкубували протягом 48 год. За 30 хв до мікроскопування до клітин додавали
флюорохром у кінцевій концентрації 1,5 мкг/мл. На чашках виготовляли тимчасові
вологі препарати, які оглядали під люмінесцентним мікроскопом ЛЮМАМ-Р2 (“ЛОМО”,
Російська Федерація) при збільшенні в 500 разів у області збудження 360-440 нм
та емісії 480-700 нм.
2.5.2. Визначення кількості апоптичних клітин за цитоморфологічними критеріями.
Ідентифікацію апоптичних клітин здійснювали на підставі аналізу морфологічних
ознак: конденсації хроматину, фрагментації ядра, та яскравості зафарбовування
фіксованих клітин флюоресцентним барвником DAPI (4,6-диамідино-2-феніліндол)
[24]. Через 48 год після опроміненя, клітини збирали та осаджували
центрифугуванням протягом 5 хв при 170 g. Надосадову рідину відбирали, а до
осаду, безперервно перемішуючи, додавали 200 мкл охолодженого фіксуючого
розчину (1 частина льодяної оцтової кислоти: 3 частини безводн
- Київ+380960830922