РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Формування дослідних груп тварин, відбір та підготовка матеріалу для
досліджень, схема проведення експериментів
У дослідах використанийепітелій тонкого кишечнику самців крапчастого ховраха
(Сitellus suslicus Gueld) віком 12-16 місяців. Досліди виконано на трьох групах
тварин, по 15 ховрахів у кожній.
У першу групу (контрольну) входили ховрахи, які знаходились в активному стані
життєдіяльності. Їх відловлювали у червні і після адаптаційного періоду (через
два тижні) використовували в дослідах. Слід зазначити, що харчовим раціоном для
цих тварин було зерно злакових рослин і вода. Вага тварин перед дослідом
складала 200-250 г. Перед забоєм, ховрахів витримували на голодній дієті
протягом 12-18 годин з необмеженим використанням води [106, 154]. Відбір
зразків кишечнику цих тварин проводили після наркотизації їх хлороформом і
послідуючої декапітації.
У другу групу входили ховрахи, які перебували в стані глибокої зимової сплячки
(стан гібернації). Їх через три місяці сплячки декапітували і відбирали
кишечник.
У третю групу входили ховрахи, які перебували в стані глибокої зимової сплячки,
і через три місяці сплячки за допомогою електричної лампи 150 Вт були
пробуджені (відстань від лампи до тіла тварини становила 100 см). Слід
відмітити, що цих тварин декапітували і відбирали зразки кишечнику при
ректальній температурі тіла +30 0С. Час пробудження ховрахів до відповідної
температури тіла складав 50-60 хвилин.
Тварини другої і третьої дослідних груп були переведені в стан гібернації в
умовах віварію. Як відомо [21], ховрах переходить у стан гібернації у другій
половині вересня. Тому, тварин було розміщено у напівпідвальному приміщенні з
температурою 8-12 0С, їм згодовували сухий корм (сіно, зерно злакових рослин) і
воду. По мірі зниження температури навколишнього середовища і температури
приміщення ховрахи впадали у зимовий сон (жовтень місяць). Характерним для
стану гібернації було те, що температура тіла ховрахів знизилась до 9-11 0С,
частота серцевих скорочень становила 11-13 уд./хв, а частота дихання Ї 10-12
дихальних рухів/хв. Ховрахи перебували у скрученій позі, яка характерна для
стану гібернації, і майже не реагували на больові подразнення. Вага тіла цих
тварин перед дослідом становила 150-180 грамів.
Схема проведення експерименту
Епітелій тонкого кишечнику крапчастого ховраха
Виділення ворсистих ентероцитів
Фракціонування на апікальні і базолатеральні мембрани
Екстракція ліпідів
Визначення складу і вмісту фосфоліпідів апікальних і базолатеральних мембран
Визначення вмісту холестеролу апікальних і базолатеральних мембран
Визначення складу і вмісту жирних кислот ліпідів апікальних і базолатеральних
мембран
2.2. Отримання ентероцитів та фракцій апікальних і базолатеральних мембран
Відділення епітеліального пласта від підслизової оболонки можливе при дії на
кишкову стінку різних чинників. На даний час описані відповідні процедури для
різних видів тварин [56, 111, 120, 144, 147, 157, 192]. Однак, залежно від
методу та об‘єкту дослідження [56], умови отримання клітин можуть
відрізнятися.
Для отримання ентероцитів тонкого кишечнику відбирали порожню кишку. Кишечник
відділяли від брижі, звільняли від вмістимого, розрізали на частки по 5 см і
ретельно промивали холодним (4-6 0С) розчином, який містив 150 мМ NaCl, 1 мМ
HEРES і доведений тріс-HCl до рН 7,4 [56].
Промиту і вивернуту частину кишечнику поміщали у розчин “А”, який містив 96 мМ
NaCl, 1,5 мМ KCl, 27 мМ цитрату Na, 5,6 мМ KH2PO4, рН 7,3, при температурі 37
0С, на 10 хвилин. Після цього кишечник переносили у розчин “Б”, який містив 140
мМ NaCl, 16 мМ Na2HPO4, 1,5 мМ ЕДТО, 0,5 мМ дитіотриїтолу, рН 7,3, струшували в
апараті “Elpan, water bath shaker type 357” (Польща) використовуючи амплітуду
коливання 9 та швидкість 180 об/хв із температурою води в ультратермостаті 37
0С протягом 5, 10, 15 та 30 хвилин [56].
Ефективність отримання клітин із тонкого кишечнику крапчастого ховраха за
сходженням їх із кишкової стінки протягом 5, 10, 15 та 30 хвилин інкубації
оцінювали мікроскопічно після забарвлення клітин трипановим синім та за
зростанням кількості клітин (мг білка) в інкубаційному середовищі з розрахунку
на 1 см2 серозної оболонки кишечнику [56, 77, 196]. Додаткову оцінку
життєздатності клітин проводили також шляхом визначення активності
лактатдегідрогенази (ЛДГ) (К.Ф. 1.1.1.27), яка виділяється в інкубаційне
середовище із клітин, що загинули [51, 56] (рис. 2.1).
Рис. 2.1. Відносне відсоткове зростання активності лактатдегідрогенази в
інкубаційному середовищі, що містить епітеліальні клітини тонкого кишечнику
крапчастого ховраха. За 100 % активності прийнято контрольну пробу з 0,05 %
розчином тритону.
Одержані нами дані показали (див. рис. 2.1), що активність цитозольного
ферменту ЛДГ стрімко наростає у клітинах, які були відібрані із середовища
інкубації після 10-ї хвилини, що свідчить про швидкий лізис клітин кишечнику.
Таким чином, оптимальним часом інкубації ентероцитів тонкого кишечнику
крапчастого ховраха є 10-хвилинна експозиція .
Після завершення інкубації клітини осаджували центрифугуванням при 500g 5
хвилин, і два рази промивали їх інкубаційним середовищем. Кінцевий осад клітин
розводили інкубаційним середовищем, переносили в конічні пробірки з
герметичними пробками (фірми Eppendorf) кількості 3 мл і зберігали в рідкому
азоті [8, 188].
Існує значна кількість методик [74, 75, 94, 114, 164, 219], проте процедура
розділення клітинної мембрани на дві протилежні фракції (апікальну і
базолатеральну) є складним у методичному відношенні процесом.
- Київ+380960830922