РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Загальна характеристика спостережень.
Експерименти проводили на 58 кролях вагою 2,5-3,5 кг, із яких 8 тварин склали
контрольну групу (табл. 2.1).
Хронічну гіперхолестеринемію моделювали на 40 тваринах, яких утримували на
атерогенній дієті, додаючи щоденно в їжу 0,3 г/кг холестерину у вигляді 0,25%
суспензії на соняшниковій олії протягом 2, 8 та 16 тижнів. Порушення ліпідного
складу сироватки крові контролювали, визначаючи вміст холестерину в плазмі
крові за Іlca і тригліцеридів за Carlson, Ignatovska [180]. Біохімічні тести
проведені у відділі біохімії Інституту кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска АМН
України (завідувач – проф. Л.С. Мхітарян).
З метою захисту міокарда від пошкоджуючого впливу хронічної гіперхолестеринемії
шляхом стимуляції пластичного забезпечення його функцій використано
різнолігандну координаційну сполуку, синтезовану на основі аденозинмонофосфату.
Попередньо проведено скринінг препаратів, синтезованих на основі
аденозинтрифосфату (РКС-1) та аденозинмонофосфату (РКС-2) на інтактних тваринах
з метою визначення найбільш ефективного з них щодо захисного впливу на
скоротливий міокард, враховуючи їх роль у стимуляції пластичного забезпечення.
Речовини РКС-1 і РКС-2 інтактним тваринам вводили внутрішньоочеревинно протягом
2 тижнів 1 раз на добу в дозі 5 мг/кг (по 5 тварин у кожній групі).
Кардіопротекторну дію препарату РКС-2, який було відібрано на підставі
результатів попередніх досліджень на інтактних тваринах, при хронічній ГХЕ
вивчали на 10 кролях за допомогою методик, використаних при дослідженнях
контрольної групи та за умов моделювання хронічної ГХЕ. Препарат вводили
аналогічним чином і в тій же дозі, що й інтактним тваринам.
Таблиця 2.1
Кількість використаних експериментальних тварин на різних етапах дослідження
№ п/п
Групи експериментальних тварин
Кількість спостережень
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Контрольна група
При 2-тижневій гіперхолестеринемії
При 8-тижневій гіперхолестеринемії
При 16-тижневій гіперхолестеринемії
Введення препаратів, синтезованих на основі АМФ та АТФ, інтактним тваринам
Введення препарату, синтезованого на основі АМФ, на фоні 16-тижневої
гіперхолестеринемії
10
10
10
10
10
Матеріал для морфологічних досліджень отримували з використанням етаміналового
наркозу (50,0 мг/кг) із дотриманням вимог гуманного поводження з тваринами. Для
зупинки серця та попередження виникнення артефактів, пов’язаних з його
виділенням з грудної клітки досліджуваних тварин, використовували
аутоперфузійну методику з охолодженим до 00С параформом [48]. Відразу після
зупинки серця його виймали з тушки тварини, клали на лід та розрізали гострим
лезом на частини для подальших досліджень.
Для морфофункціонального аналізу змін скоротливого міокарда, обумовлених
впливом гіперхолестеринемії, та ефективності фармакологічно активних речовин,
що застосовувалися для корекції цих змін, було використано комплекс
світлооптичних, електронномікроскопічних методик та морфометрії (табл. 2.2).
2.2. Методи досліджень.
2.2.1. Гістологічне дослідження.
Для гістологічних досліджень тканину міокарда фіксували у 10% розчині
нейтрального формаліну, зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації і
заливали у парафінові блоки. Гістотопограми серця забарвлювали гематоксиліном і
еозином та пікрофуксином за Ван Гізон [68]. Для виявлення дрібновогнищевих
пошкоджень міокарда використовували методику Лі та Рего [303], загальний стан
скоротливого апарату КМЦ оцінювали фізико-оптичним методом під
інтерференційно-поляризаційним мікроскопом МРІ-5 [68, 121]. Кількість ядерцевих
організаторів, що визначає РНК-синтезуючу функцію клітин міокарда,
встановлювали за допомогою азотнокислого срібла за методикою Хауела та Блека в
модифікації М.М.Мамаєва з співавт. [130].
2.2.2. Трансмісійна електронна мікроскопія та гістохімія.
Зразки тканини лівого шлуночка серця швидко промивали охолодженим 0,1М
фосфатним буфером (рН 7,2-7,4), фіксували в ізотонічному 4% розчині параформу
на цьому ж буфері [54, 224] і дофіксовували в ізотонічному забуференому 1%
розчині OsO4 з додаванням сахарози [86]. Після фіксування та зневоднення в
спиртах зростаючої концентрації зразки тканини пропитували епоксидними смолами
і заливали в блоки з суміші епону та аралдиту [86]. Напівтонкі зрізи
забарвлювали метиленовим синім та основним фуксином з метою встановлення місця
дослідження [222]. Ультратонкі зрізи отримували на приладі LKB-8800 (Швеція),
контрастували їх солями важких металів (ураніл-ацетат і цитрат свинцю) за
Рейнольдсом. Дослідження і фотографування об’єктів, підраховування
ультраструктур КМЦ в одному полі зору проводили за допомогою електронного
мікроскопу “ПЭМ-125 Україна” при апертурній діафрагмі 30-40 мкм та прискорюючій
напрузі 75 кВ.
Електронногістохімічними методами виявляли розподіл і концентрацію
некомпенсованих негативних зарядів глікозаміногліканів (ГАГ) глікокалікса
(реакція зв’язування феризоля за Б. Ветцель) [54]; концентрацію та розподіл
Са2+ в КМЦ за допомогою N,N-нафтолоілгідроксиламіну натрію (НГА) [334];
Са2+-зв’язуючий потенціал сарколеми (реакція з іонізованим лантаном) [299];
бар’єрні властивості сарколеми з використанням дрібнодисперсних маркерів таніну
і колоїдного лантану [311]. Рибонуклеопротеїди (РНП) в міокарді виявляли на
парафінових зрізах за методикою Браше з контрольною обробкою рибонуклеазою. На
кріостатних зрізах зі свіжезамороженої в рідкому азоті тканини визначали:
глікоген (за Мак-Манус), активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ),
сукцинатдегідрогенази (СДГ
- Київ+380960830922