РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
С целью достижения поставленной цели и научного обоснования целесообразности дифференцированного подхода к вакцинации против вирусного гепатита В новорожденных и детей первого года жизни проанализировано состояние здоровья 2596 человек, в том числе 1998 случаев - архивного материала (999 историй родов и 999 историй развития новорожденных), 578 - собственных обследований, 20 - группы сравнения.
Предложены рабочие гипотезы, которые необходимо подтвердить нашими исследованиями:
1. Особенности адаптации новорожденных обеспечивается состоянием здоровья новорожденных и матерей.
2. Дифференцированный подход к вакцинации против вирусного гепатита В обоснованный.
3. Вакцинация против вирусного гепатита В новорожденных и детей первого года жизни обеспечивается специфической защитой организма.
Исследования отвечают всем этичным нормам, предъявляемым к научным работам, получено разрешение комитета по этике Донецкого национального медицинского университета им. М. Горького МЗ Украины. Перед обследованием детей все матери были информированы о характере исследований, которые проводились после получения разрешения на участие в них. Работа выполнена на базе ЦГКБ №1, ГДБ №2 г. Донецка, ГДБ г. Артемовска, ЦНИЛ ДГМУ, лаборатории "Надія".
Обследование проводились по разработанной нами программе, которая включала 3 этапа.
На I этапе с целью объяснения риска развития затяжной непрямой гипербилирубинемии у новорожденных было проведено ретроспективное эпидемиологическое исследование 999 историй родов и 999 историй развития новорожденных детей.
На II этапе с целью выяснения причин развития затяжной непрямой гипербилирубинемии у новорожденных, вакцинированных и не вакцинированных против вирусного гепатита В, проводилось углубленное клинико-лабораторное обследование 289 новорожденных с непрямой гипербилирубинемией.
На III этапе у 94 новорожденных с затяжной непрямой гипербилирубинемией оценка иммунологического статуса проводилась на основе комплексного изучения показателей клеточного (абсолютное и относительное содержание в периферической крови Т-лимфоцитов) и гуморального (относительное и абсолютное содержание в периферической крови В-лимфоцитов, сывороточных иммуноглобулинов класса А, М, G) иммунитета, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), индекс сдвига, лимфоцитарный индекс, лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ), метаболизма по УСМ в плазме крови и общего реактивного потенциала (НЭК, КФП, ИЛП, АНО).
Состав сывороточных иммуноглобулинов класса А, М, G определялся у всех новорожденных методом простой радиальной диффузии в агаре на иммунодиффузных пластинках фирмы "Sevac" с применением моноспеци-фических сывороток против иммуноглобулинов классов А, М, G института им. И.И. Мечникова, Москва (G. Mancini et al. 1965). Стеклянные пластинки размером 9-12 см покрывались равномерным слоем "агар + моноспецифическая антисыворотка". Для этого на пластинку помещалась латунная П-образная рамка толщиной 1 мм, сверху помещается вторая стеклянная пластинка, смоченная гидрофобной жидкостью, и антисыворотки в количестве 9 мл. В слое агара с антисывороткой пробойником вырезались лунки диаметром 2 мм, на расстоянии 15 мм одна от другой. На пластинке делались несколько рядов лунок. В лунки первого ряда вносилось с помощью микрошприца по 2 мкл стандартной сыворотки не разведенной и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8. Лунки следующих рядов заполнялись испытуемыми препаратами. Пластины инкубировались во влажной камере в течение 24 часов при температуре +4 0С, а пластины с анти-Ig M сывороткой - 48 часов. По окончании инкубации измерялись диаметры колец преципитации при помощи штанген-циркуля. Уровень иммуноглобулинов определялся по калибровочной кривой. В качестве нормативов были использованы данные литературы (Фомина Т.В. и соавт., 1974).
Определение общего количества Т-лимфоцитов в периферической крови производилось методом спонтанного розеткообразования (Е-РОК) с эритроцитами барана, предложенным М. Jondal et al., 1972, в модификации А.М. Чередеева и соавт., 1976; В-лимфоцитов - методом розеткообразования, предложенным N.F. Mendes, 1978 [179, 180].
Материалом для исследования служила гепаринизированная кровь в объеме 3 мл, взятая из пуповины новорожденных. Выделение взвеси лимфо-цитов проводилось путем центрифугирования плазмы в течение 10-15 минут, после осаждения и удаления, в присутствии 10% желатины, красных кровяных телец. Полученная взвесь лейкоцитов использовалась для определения розеток.
Для определения Т-розеток к взвеси лейкоцитов добавлялись установленной концентрации эритроциты барана, а для В-лимфоцитов использовались частицы зимозана, нагруженные комплементом, и эритроциты барана. На завершающем этапе проводилась фиксация клеток 3% раствором глютаральдегида. Приготовленные препараты затем фиксировались метанолом и окрашивались по Романовскому. Розеткой считалась клетка, связавшая не менее 3-х эритроцитов барана. Число Т- и В-лимфоцитов вычислялось в процентах и в абсолютных цифрах на 1 мкл крови.
Абсолютное содержание лимфоцитов определялось по формуле:
х=А+В+С, (2.1),
где А - количество лейкоцитов в 1 мм3 крови; В - процент лимфоцитов в формуле крови; С - процент клеток, образующих розетки.
Способность Т- и В-лимфоцитов к розеткообразованию определялась путем использования дополнительного теста, который раскрывает качественную характеристику этого феномена. С этой целью вычисляли индекс способности Т- и В-лимфоцитов к розеткообразованию - отношение количества клеток, образующих полные розетки, к количеству клеток, образующих розетки.
При изучении лейкоцитограммы периферической крови новорожденных определялось общее количество лейкоцитов, а также процентное содержание палочкоядерных, сегментоядерных нейтрофилов и агранулоцитов: лимфоцитов и моноцитов. Изучались и различные индексы,