РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Основні етапи досліджень
Основні етапи досліджень взаємодії ендофітних бактерій з рослинами картоплі представлено на рис. 2.1.
Рис. 2.1. Загальна схема досліджень
2.2. Біологічний матеріал для проведення досліджень
Рослинний матеріал. Для досліджень по вивченню взаємодії рослин картоплі з ендофітними бактеріями були відібрані бульби картоплі (Solanum tuberosum L.) сортів Нігру, Загадка, Червона Рута з розсадника відділу селекції Інституту картоплярства УУАН під керівництвом А.А. Осипчука. Для визначення ролі ендофітних бактерій асоційованих з рослинами у індукуванні системної стійкості використовували рослини арабідопсису (Arabidopsis thaliana L. Heyhn) екотипу Колумбія Col-0 (Cold Spring Harbor, США).
Бактеріальні культури. В експериментах з інокуляції використовували штам Pseudomonas fluorescens IMБГ163 з колекції Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ. Для біотесту індукованої системної стійкості використовували штами Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 та Pseudomonas fluorescens WCS417r, які було отримано від доктора П. Бекера (Уагіненський університет, Нідерланди).
2.3. Мікробіологічні та фізіолого-біохімічні методи
Поживні середовища для вирощування бактерій та умови їх культивування. Ризобактерії P. fluorescens IMБГ163 вирощували у рідкому поживному середовищі КВ [145] протягом 18 годин при температурі 28 ?С з аерацією, використовуючи термостатичну качалку з круговими обертами (амплітуда 5 см, швидкість 150-200 об/хв).
Баткеріальний штам Methylobacterium radiotolerans ІМБГ290 вирощували на поживному мінеральному середовищі Кадама [146] або М9 [147] з додаванням 1% метанолу при температурі 28 ?С протягом 3-5 днів.
Інокуляція паростків картоплі ризобактерією P. fluorescens ІМБГ163. В експериментах з інокуляції використовували сорти картоплі Нігру і Загадка. Бульби картоплі пророщували у стерильному піску протягом 2-3 тижнів при повній темряві. З пророщених бульб видаляли меристематичні зони паростків картоплі довжиною 3-4 см. Ізольовані експланти картоплі переносили в чашки Петрі і проводили інкубацію їх протягом 90 хв в бактеріальноій суспензії P. fluorescens ІМБГ163 концентрацією 108 кл/мл. Після інкубації в бактеріальній суспензії апікальні зони експлантів почергово стерилізували у розчинах 70% етилового спирту протягом 15 сек та 5% гіпохлориту кальцію - 3 хв [148] з подальшою трьохкратною відмивкою в стерильній дистильованій воді. Відмиті експланти переносили на агаризоване безгормональне середовище MC [149] для отримання регенерації рослин. Культивування проводили при 16 годинному світловому фотоперіоді, температурі 24 0С, відносній вологості 80-85% та освітленості 4 тис. люкс. Отримані рослини-регенеранти розмножували методом клонального мікророзмноження [150].
Встановлення присутності P. fluorescens ІМБГ163 у рослинах. Для виявлення бактерій P. fluorescens ІМБГ163 в отриманих рослинах-регенерантах картоплі в умовах in vitro після інокуляції експлантів, робили неглибокі надрізи на листкових пластинках і коріннях 3-4 тижневих рослин, які після цього висаджували в чашки Петрі на селективне поживне середовище КВ для культивування матеріалу при температурі 28 0С протягом двох діб.
Виділення ендофітних бактерій. Бактерії виділяли з внутрішніх тканин рослин-регенерантів картоплі, поверхню яких продезинфіковано у 70% етиловому спирті - 1 хв і 6% гіпохлориті кальцію - 20 хв [151] та відмито у стерильній bdН2О. Рослинний матеріал розтирали у стерильній ступці і інокулювали на агаризовані середовища LB, M9 [147], КВ [145], з метанолом [146], МПА, розведене у 6 та 20 разів стерильною dН2О. Бактерії виділяли з регенерантів картоплі (окремо з коріння, листя та стебел), як оброблених ризобактеріями, так і контрольних рослин картоплі.
Визначення антагоністичної активність ендофітів до бактеріальних патогенів. Атагоністичну активність бактеріальних ізолятів визначали in vitro в тестах на чашках Петрі методом підсіву бактерій радіальними штрихами до бактерії-антагоністу [152]. В центрі чашки на агаризованому середовищі вирощували одну колонію досліджуваних бактерій. Після того, як колонія добре виросла до неї, радіальними штрихами, підсівали фітопатогенні бактерії Erwinia carotovora subsp. atroseptica та Рseudomonas syringae pv. syringae. Інкубацію чашок проводили у термостаті при 28 0С протягом доби.
Біотест індукованої системної стійкості рослин. Біотест стійкості проводили на рослинах арабідопсису (Arabidopsis thaliana) до некротрофного фітопатогену P. syringae pv. tomato DC3000 [108]. Бактерії P. syringae pv. tomato DC3000 вирощували на агаризованому середовищі КВ та інкубували при 28 0С 2 доби. Клітини знімали з поверхні агару та суспендували у стерильній дистильованій воді з додаванням твіну-20 (Сігма, США) (200 мкл/л-) до кінцевої концентрації 108 КУО/мл. Насіння арабідопсису поверхнево стерилізували 6% гіпохлоритом натрію, що містив 0,1% тритон Х-100, відмивали стерильною dH2O та витримували при 4 0С 2 доби для покращення проростання. Насіння переносили у низкоплавку агарозу (0,4%). Рослини вирощували при 23 0С та натуральному освітленні у кондиціонованому приміщенні.
Через два тижні арабідопсис переносили у камери діаметром 10 см, наповнені субстратом. П'ять мілілітрів суспензії ендофітних бактерій титром 108-109 КУО/г субстрату вносили під-час трансплантації рослин та через тиждень після трансплантації. Через тиждень після останнього внесення ендофітних бактерій, суспензію P. syringae pv. tomato DC3000 розприскували на поверхні листя. Інокульовані рослини переносили у вологу камеру на дві доби у темряву і витримували при 27 0С. Через 7 діб ступінь захворювання рослини визначали у відсотках за кількістю листків неураж