РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Експеримент проводили на 85 лабораторних білих щурах (всі самці) (рис. 2.1). Середня вага тварин перед початком експерименту становила 235,4±24,5 г. Контрольну групу склали 10 тварин, які утримувалися в тих же умовах, що й тварини експериментальних груп.
Цукровий діабет моделювали на 75 тваринах (всі відносні величини розраховували від цієї кількості тварин) шляхом внутрішньочеревного введення водяного розчину алоксану в дозі 200 мг/кг. Розчин тетрагідрату алоксану (Fluka, Німеччина) готували безпосередньо перед введенням шляхом розчинення його в стерильній дистильованій воді. Стерильності розчину домагалися шляхом фільтрації його через мембрану Millex-GV з фільтром 0,22 мкм (Millipore, Франція).
Після введення алоксану у 3 (4,0%) тварин розвинувся вкрай важкий стан із гіперглікемією вище 30 ммоль/л, тому вони були виведені із експерименту на 3-4 доби. На 30 добу після розвитку в щурів цукрового діабету для подальшого експерименту було відібрано 65 щурів зі станом середньої важкості (з рівнем глюкози крові натще від 8 до 16 ммоль/л). З них 3 тварини виведені з експерименту для одержання даних про зміни у структурі підшлункової залози перед трансплантацією (контроль моделі).
Тварини були поділені на 4 експериментальні групи. Тваринам 1 групи (14 тварин) трансплантацію клітинних культур не проводили, на 30 добу експерименту їм внутрішньочеревно вводили 1 мл стерильного фізіологічного розчину. Дві тварини цієї групи загинули на 35 і 37 добу експерименту. Тваринам 2 групи (24 тварини) на 30 добу вводили внутрішньочеревно культуру острівкових клітин ПШЗ. На 38 добу експерименту 1 тварина цієї групи загинула. На 38 добу експерименту 12 тваринам цієї групи повторно ввели аналогічну культуру (група 2Б), тварини, що залишися, склали групу 2А. Тваринам 3 групи (12 тварин) на 30 добу експерименту вводили внутрішньочеревно зруйновану шляхом дворазового циклу заморожування-розморожування культуру острівкових клітин ПШЗ. На 35 добу 1 тварина цієї групи загинула. Тваринам 4 групи (12 тварин) на 30 добу однократно внутрішньочеревно вводили культуру гемопоетичних стовбурових клітин. Для отримання проміжних морфометричних результатів на 45 добу експерименту по 3 тварини з кожної групи виводили з експерименту. Всі інші тварини були виведені з експерименту на 70 добу. В усі терміни тварин виводили з експерименту шляхом декапітації під загальною анестезією кетаміном в дозі 75 мг/кг. При постановці експерименту ми керувалися "Загальними етичними принципами експериментів на тваринах", ухваленими Першим національним конгресом з біоетики 20 вересня 2001 р., Київ, Україна. Протокол експерименту узгоджений із комісією з біоетики Донецького державного медичного університету.
Культури алогенних гемопоетичних стовбурових клітин і ксеногенних кролячих ендокринних клітин підшлункової залози були отримані у Лабораторії клітинного та тканинного культивування Інституту невідкладної і відновної хірургії ім. В.К.Гусака АМН України (завідувач лабораторії - д.мед.н., доц. Попандопуло А.Г.). Лабораторія створена у спеціально збудованому приміщенні і відповідає найвибагливішим стандартам щодо стерильності і чистоти повітря. Стисло процес отримання клітинних культур описаний далі.
Для приготування культури алогенних гемопоетичних стовбурових клітин щурячі плоди 14 діб гестації отримували у вагітних самок шляхом гистеректомії під загальною анестезією у стерильних умовах. Вилучену матку поміщали у розчин консерванту з антибіотиками - середовище Ігла (Інститут поліомієліту і вірусних енцефалітів, Росія) з пеніциліном і стрептоміцином - та терміново передавали до Лабораторії клітинного та тканинного культивування.
Рис. 2.1. Схема експерименту
Приготування клітинних суспензій здійснювалося згідно з загальноприйнятою технологією, яка включала наступні етапи: вилучення ембріонів, вилучення з них ембріональної печінки, механічну дезагрегацію та фільтрацію через декілька фільтрів з мінімальним розміром пор у 0,45 мкм, лізис еритроцитів за допомогою лізуючого буферу BD PharmLyse (BD Biosciences Pharmingen, США).
Суспензію гомогенізованої ембріональної печінки висівали на пластикові культуральні флакони (Nunclon, Данія), що містили поживне ростове середовище Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) (Sigma, США) із 10% ембріональною телячою сироваткою (Біолот, Росія), через 1 годину культивування при 37°С надосадову рідину із клітинами, що не прикріпилися до культурального флакону, зливали. Таким чином клітинна суспензія очищувалася від субстрат-залежних клітин, які прикріплялися на дні культурального флакону, тобто, від епітеліальних, стромальних і мезенхімальних стовбурових клітин та інших негемопоетичних клітин. Гемопоетична популяція клітин ембріональної печінки залишалася у надосадній рідині через свої неадгезивні (субстрат-незалежні) властивості. Отриману суспензію гемопоетичних клітин розділяли на порції об'ємом 0,3 мл і терміново вводили щурам-реципієнтам.
Тестування вмісту стовбурових клітин у клітинній суспензії робили у одній із порцій (0,3 мл). Для детекції гемопоетичних стовбурових клітин використовували імунотипування клітин на проточному цитометрі FACSCalibur (Becton Dickinson, США) з визначенням загальної кількості ядровмістних клітин на одиницю об'єму та відносної кількості клітин із фенотипом CD90(Thy-1.1)+/CD3-/CD45RC-, тобто клітин, які несуть маркер стовбурових і ранніх прогеніторних клітин і які не несуть маркери диференціювання Т- та В-клітин. За свідченням багатьох авторів [11,19,24,68,118], саме ця популяція клітин щурів містить велику кількість стовбурових гемопоетичних клітин. Для імунофарбування клітин перед цитометрією використовували моноклональні антитіла до антигену CD90(Thy-1.1) (клон OX-7, флуоресцентна мітка - ізотіоціанат флуоресцину (FITC)), антигену CD3 (клон G4.18, флуоресцентна мітка - фікоеритрин (PE)), антигену СD45RC (клон OX-22, флуоресцентна мітка PE). Усі