РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объект исследования
Объектом исследования служили взрослые особи черноморского двустворчатого моллюска Mytilus galloprovincialis Lam. обоего пола одного срока оседания. Длина раковины составляла 50-60 мм.
В сравнительных исследованиях использовали мидий трех групп - с черной, коричневой окраской раковины и особей с депигментированными тканями. Установлено, что окраска раковины у M. galloprovincialis является генетически детерминированным признаком [19], в связи с чем выделяют 2 основные цветовые морфы черноморской мидии - черную (черно-фиолетовую) и коричневую [12, 19]. Необходимо отметить, что мидии с разной окраской раковины населяют разные экотопы. Так, мидии черной морфы обитают преимущественно в прибойной зоне на твердых субстратах (скаловая форма). Коричневые особи, напротив, приурочены к донным местообитаниям (иловая форма) [12, 81]. Условия существования в указанных экотопах отличаются по ряду параметров, в том числе и по степени насыщения воды кислородом, что непосредственно влияет на уровень окислительной нагрузки в тканях моллюсков.
Моллюски с депигментированными тканями (далее - моллюски с ДТ) представляют группу особей, редко встречающихся (не более 1-2%) среди популяций черноморской мидии. Впервые моллюски с ДТ были описаны А.В. Пирковой с соавторами, которые исследовали популяционно-генетические особенности этих особей [99].
Мидии черной морфы характеризовались наличием черно-фиолетовой окраски створок раковины, темно-фиолетового, почти черного мантийного края и темно-коричневой ноги, хорошо развитой окраской внутренних органов (темный зелено-коричневый гепатопанкреас, розовато-бежевые жабры) (рис. 2.1).
Раковина мидий коричневой морфы имела желто-коричневую окраску (совершенно лишенную синего пигмента) нескольких оттенков - от светло- до темно-коричневых тонов [12]. На раковине отдельных особей имелись темные полосы, расположенные в продольном направлении. Мягкие ткани мидий данной группы так же, как и у черных особей, имели хорошо выраженную окраску (темно-коричневые мантийный край и нога, темный зеленовато-коричневый гепатопанкреас, розовато-бежевые жабры) (см. рис. 2.1).
Моллюски третьей группы (мидии с ДТ) характеризовались наличием мантийного края и ноги молочно-белого цвета, слабо окрашенных жабр (бледно-бежевая окраска) и гепатопанкреаса (светло-коричневая окраска) (см. рис. 2.1). Цвет раковины у мидий с ДТ может быть различным. В настоящем исследовании использовали моллюсков, имевших полупрозрачную раковину зеленовато-бурой окраски светлого оттенка с характерной продольно-радиальной полосатой исчерченностью (расположение темных полос - продольное, от верхушки раковины к ее широкому краю), а также мидий с раковиной светлой желто-коричневой окраски.
2.2. Сбор и транспортировка материала
Моллюски были собраны в марте 2001 г. с коллекторных установок НИЦ "Государственный океанариум" в бухте Казачья и в январе 2006 г. с коллекторов ЧП "Морепродукт" в бухте Севастопольской (район Севастополя, Черное море). В каждом случае весь материал для эксперимента отбирали одномоментно. Транспортировку животных осуществляли в контейнере (объемом 10 л) насыпью без воды в течение 1 часа от момента сбора.
После сбора и транспортировки моллюсков выдерживали в аквариумах (объемом 30 л) с проточной аэрированной морской водой в течение 2-3 суток, что, согласно работам ряда авторов, является достаточным для снятия состояния стресса [229, 262, 271].
2.3. Модельные эксперименты
В рамках проведения модельных экспериментов было выполнено 2 серии исследований: по изучению влияния на состояние АО комплекса моллюсков нереста (модель естественного окислительного стресса) и катионного детергента ТДТМА (модель искусственного окислительного стресса).
2.3.1. Моделирование нереста у моллюсков в лабораторных условиях. Нерест индуцировали с использованием метода температурной стимуляции, для чего животных помещали в аквариумы с температурой проточной морской воды на 3оС выше (+10 оС), чем в естественных условиях (+7 оС) [98]. О состоянии нереста судили по факту выброса половых продуктов. Анализ состояния гонад осуществляли визуально в момент препарирования моллюсков. Стадии зрелости гонад определяли согласно общепринятым методам по 6-балльной шкале: 1 - пустая неразвивающаяся гонада; 2 - начало формирования; 3 и 4 - сформированная гонада (преднерестовое состояние); 5 - вымет гамет (нерестовое состояние); 6 - посленерестовая перестройка и резорбция ооцитов и сперматозоидов [12, 124].
На основании результатов наблюдения моллюсков разделили на 2 группы согласно общепринятой классификации [124]. К первой группе отнесли моллюсков, которые после температурной стимуляции нереста не выметали половые продукты. Эта группа объединила особей II и III стадий зрелости гонад (II стадия - начало гаметогенеза, характеризующееся слабым наполнением гонад; III стадия - сформированные, готовые к вымету гонады). Во вторую группу вошли мидии, находившиеся на IV стадии зрелости, при которой гонады находятся в состоянии частичного (порционного) вымета половых продуктов (собственно нерестовая стадия).
2.3.2. Моделирование токсической нагрузки. В качестве токсического агента в данном эксперименте был использован катионный детергент тетрадецилтриметиламмоний бромид (ТДТМА). Это соединение относят к числу наиболее распространенных и токсичных соединений [89-92, 114]. Являясь катионным поверхностно-активным веществом, ТДТМА способен индуцировать ПОЛ в клеточных мембранах и способствует развитию у моллюсков состояния окислительного стресса [236, 278].
В исследованиях были использованы мидии с черной и коричневой окраской раковины в состоянии относительного физиологического покоя (преднерестовый период).
Мидий обеих групп содержали в ваннах с фильтрованной морской водой объемом 30 л. Животных опытной группы подвергали воздействию TДTMA в концентрации 0,8 м