РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження проведено на базі проблемної науково-дослідної лабораторії фізіології та функціональної морфології продуктивних тварин Дніпропетровського державного аграрного університету протягом 2003-2007 років.
Об'єктом дослідження були поросята білої української породи навчального господарства "Самарський" Дніпропетровського державного аграрного університета.
Для морфологічних досліджень органів кровотворення методом гострого знекровлення проводили забій добових, 3-х, 5-ти, 10-ти, 15-ти, 20-, 30-ти, добового віку, по 6 голів кожної вікової групи та 60-ти добових - 5 голів, всього 47 голів (табл. 2.1). Після забою шляхом анатомічного препарування відбирали необхідний для дослідження матеріал.
Визначали абсолютну та відносну масу осьового скелета та скелета кінцівок (до живої маси).
Цілі кістки осьового скелета та скелета кінцівок фіксували при кімнатній температурі в 3,0-5,0 % розчині формаліну протягом 3-5 діб (в залежності від їх розмірів), а потім у 10,0 % розчині протягом 14-20 діб.
За допомогою рентген-установки 12П5 виготовляли рентгенограми цілих кісток та їх розрізів. Грудні хребці, ІІІ плеснову та плечову кістки розпилювали в сагітальній площині, а стегнову кістку - у сегментальній. Для зйомки використовували ліві половини хребців, у стегновій кістці частину з великим вертлюгом, а в плечовій - з великим м'язовим горбком.
Розпилені кістки викладали на касету розпилом донизу, ребра та хвостові хребці донизу латеральною поверхнею, груднину - вентральною. Режими зйомки: фокусна відстань 40 см., напруга в трубці 40 кВ, анодний струм 40 мА, експозиція від 6 до 18 с., плівка РП-1С "ОНІКО", касети м'які, виготовлені із світлонепроникного паперу.
Таблиця 2.1
Кістка Вік, добаВсього 1 3 5 10 15 20 30 60 Осьовий скелетчереп6666666547хребці:
шийні4242424242424235329грудні9090909090909075705поперекові4242424242424235329крижова кістка2424242424242420188хвостові120120120120120120120150940реберні кістки1801801801801801801801501410груднина6666666547 Скелет кінцівокплечова121212121212121094передпліччя121212121212121094зап'ястка121212121212121094п'ястка121212121212121094фаланги пальців121212121212121094стегнова121212121212121096великогомілкова121212121212121094заплесна121212121212121094плесна121212121212121094фаланги пальців121212121212121094Разом6306306306306306306305254935Матеріал досліджень
На рентгенограмах визначали наявність та ступінь розвитку кожного осередка окостеніння (ООК) (діа-, епі- та апофізарні), а також їх відносну площу (ВП) до загальної площі рентгенівського відображення органа.
Для підрахунку ВП ООК на рентгенограми накладали сітку для морфометричного аналізу, яку виготовляли за методикою Г.Г.Автанділова [6] та проводили диференційований підрахунок крапок, що потрапили на всю площу рентгенівського відображення органа та на площу окремих ООК. Відносну площу кожного ООК до загальної площі рентгенівського відображення підраховували за формулою: Sвідн.= Рк/Рз ? 100 %, де Sвідн - відносна площа ООК, %; Рк - кількість крапок, що потрапили на площу ООК; Рз - кількість крапок, що потрапили на всю площу рентгенівського відображення кістки.
Для виготовлення морфометричної сітки використровували рентгенівську плівку, звільнену від емульсії шляхом занурення її протягом 20-30 хвилин в 20% розчин їдкого лугу (КОН). За допомогою міліметрового паперу голкою наносили на плівку рівновіддалені крапки (1мм).
Для гістологічних досліджень кістки після фіксації декальцинували в 10% розчині трилону Б на 4% розчині формаліну та в розчині Шморля (мурашина кислота 90% - 500мл, формальдегід 40% - 50мл, дистильована вода 450мл).
Із декальцинованих кісток за допомогою леза вирізали серединні фрагменти, враховуючи анатомічні особливості кожної кістки.
Із тіл хребців (5-го грудного, 1-го, 5-го хвостового) вирізали ділянки в сагітальній площині, з 5-ої реберної кістки - в парасагітальній, з гілки нижньої щелепи - в сегментальній. Трубчасті кістки кінцівок попередньо розрізали навпіл та вирізали ділянки із плечової та плеснової в сагітальній площині, а із стегнової - в сегментальній. Вирізані з кісток ділянки промивали під проточною водою протягом 24 годин.
Тотальні тонкі зрізи товщиною 10-15 мкм, призначені для забарвлення суданом ІІІ, виготовляли на мікротомі-кріостаті МК-25 при температурі -15 - -18°С (табл.2.2).
З метою фіксування ділянок кісток на об'єктотримачі використовували 4% водяний розчин желатини. Для попередження руйнування кістки під час зрізання на її поверхню наносили суміш наступного складу: швидкорозчинна харчова желатину - 1,5 г, гліцерин - 20 мл, вода до 100 мл.
Для забарвлення гематоксиліном і еозином, азур ІІ-еозином, імпрегнації сріблом виготовляли парафінові зрізи.
Таблиця 2.2
Розподіл матеріалу за методиками досліджень
Кістки Методики морфометрія гістологічні гемато-логічні гістохімічні (маса, щільність) рентгенографія гематоксилін еозин імпрегна-ція сріблом азур ІІ-еозин судан ІІІ за Браше (метиловим зеленим піроніном) Осьового скелета 47 - - - - - - нижньощелепна 47 16 47 32 24 16 8 хребці:
4-тий шийний 47 16 - - - - - 5 гудний 47 16 47 32 24 16 8 3-й поперековий 47 16 - - - - - 1-ий хвостовий 47 16 47 32 24 16 8 5-ий хвостовий 47 16 47 32 24 16 8 5 реберна кістка 47 16 47 32 24 16 8 груднина 47 16 47 32 24 16 8 Скелет кінцівок 47 - - - - - - плечова 47 16 47 32 24 16 8 передпліччя 47 16 - - - - - стегнова 47 16 47 32 24 16 8 великогомілкова 47 16 - - - - - плеснова 47 16 47 32 24 16 8 Разом 705 611 208 288 216 144 72 Заливання кісткових фрагментів