РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Клінічні спостереження покладені в основі даної роботи проводилось за даними медичної документації Правобережного центру передчасних пологів міста Києва(КМПБ№7). Проведена клініко-статистична обробка 200 історій пологів вагітних та клінічне спостереження з аналізом факторів перинатального ризику 123 недоношених немовлят.
До складу лікувально-профілактичних заходів відносили антибактеріальну токолітичну терапію, проводили профілактику РДС-синдрому в залежності від терміну вагітності, клінічного стану вагітної, роділлі або породіллі.
Методи дослідження, використані в роботі: аналіз історій пологів та історій новонароджених, бактеріоскопічні та бактеріологічні методи дослідження, проведення антенатального контролю за станом плода (УЗД, КТГ, доплерометрія), імунологічні дослідження, електронно-мікроскопічне дослідження плаценти та плодових оболонок.
В умовах стаціонару вагітним проводилось повне клінічне обстеження за загально прийнятими методиками, проводились апаратні методи дослідження функціонального стану плода. Для цього був застосований ультразвуковий сканер фірми Philips EnVisor з використанням пакетів програмного забезпечення, який містить доплерівський блок. Кардіотокографію виконували за допомогою фетального монітора фірми Hewlett-Packard's 50A (Німеччина, 1995). Оцінювали біофізичний профіль плода за методикою А.М.Vintzileos та співавторів (1989). Для стандартизації умов всі дослідження проводились з 10 по 13 год дня, кожне дослідження проводилось протягом 30 хв.
При бактеріологічному методі бактеріальне дослідження з визначенням чутливості до антибіотиків проводили кожні 7 діб тривалості безводного проміжку із цервікального каналу, а також із навколоплідних вод. Мікроскопічне дослідження виділень із цервікального каналу проводили кожні 7 діб. Мікробіологічне дослідження включало такі етапи:
- виключення захворювань, що передаються статевим шляхом, мікроскопія мазка із піхви зафарбованого за Грамом, посів із піхви виділень проводився на факультативно-анаеробну та облігатну флору умовно-патогенних мікроорганізмів. При кількісній характеристиці мікрофлори були застосовані критерії R. P. Nugent та співавторів (1991), модифіковані А. С. Анкирській (1996). Якісна оцінка мікрофлори включала диференціацію усіх морфотипів за їх морфологічними ознаками. Для оцінки факультативно-анаеробної частини мікробіоценозу застосовували 5% кров'яний агар, середовище для генітальних мікоплазм, середовище Сабуро (для грибів), середовище МРС (для лактобацил). Забір матеріалу у перший раз проводили при поступленні вагітних у клініку до призначення антибіотиків, під час огляду у дзеркалах.
Матеріалом імунологічних досліджень була периферійна кров, яку брали натщесерце. Визначали вміст циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) за методом Digeon (1977), рівень імуноглобулінів (Ig) A, M, G - за методом Mancini (1965), поглинальну активність (ПФ - процент фагоцитозу та ФЧ - фагоцитарне число) нейтрофілів (Нф) та моноцитів (Мц) з частинками латексу (1,5 мкм) - за методом Т.І. Івчик [55], функціональну активність - по здібності клітин відновлювати нітросиній тетразолій (НСТ) у спонтанному тесті (сНСТ), функціональний резерв (оцінювали по різниці спонтанного та індукованого (ін-т) пірогеналом (1,25 мкг/мл) тестів [233]. Фенотипування лімфоцитів з антигенними детермінантами CD3+(Т-лімфоцити), CD4+(Т-хелпери), CD8+(Т-супресори), CD16+ (природні кілери), CD19+9(В-лімфоцити), CD25 (ІЛ-2-рецептор на активних клітинах) проводили на приладі "FACSCAN"(Becton Dickinson, США) з використанням моноклональних антитіл фірми "Bioprobe BW"(Голландія) згідно інструкції виробника. Вміст СРП в сироватці крові визначали за допомогою імуноферментних тест - систем фірм Diagnostic Automation (Канада).
Стан системи інтерферону оцінювали за показниками ІФН-статусу організму в культурі клітин периферійної крові визначали рівень продукції in vitro ІФН-у у відповідь на індукцію ФГА та ІФН-? у відповідь на індукцію вірусом хвороби Ньюкастла (штат Канзас). А також вміст ІФН у сироватці крові [52]. ІФН титрували в диплоїдній культурі клітин людини М-19 із використанням вірусу везикулярного стоматиту, штат Індіана, як тест-вірусу. За одиницю активності ІФН приймали величину, зворотну максимальному розведенню, яке затримує цитопатичну дію тест-вірусу на 50% [81].
Біологічну активність фактору некрозу пухлин (ФНП) у культуральному середовищі клітин периферичної крові, стимульованих ліпополісахаридом (стимульований тест) та відсутності стимуляції (спонтанний тест) оцінювали за загальноприйнятою методикою [81].
Вміст ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-10 визначали за методом імуноферментного аналізу з використанням тест-систем ("ProCon", Росія та Amersham, США) в супернатантах МНПК, які отримували після 24 год інкубації при 37°С (концентрація клітин в культуральному середовищі складала 1,5 млн. в 1 мл).
При статистичній обробці результатів використовували програму "Microsoft Excell", вірогідність відмінностей розраховували за критерієм Ст?юдента.
Рівень антикардіоліпінових антитіл (аКЛ) в сироватці крові вагітних визначали імуноферментним методом з використанням тест-системи (ORCENTEC Diagnostica GmbH, Німеччина).
Матеріалом для електронно-мікроскопічного дослідження була материнська частина плаценти та амніотична оболонка породіль.
Матеріал після подрібнення фіксували у 2,5% розчині глютарового альдегіду на фосфатному буфері на протязі 1 год з наступною дофіксацією ОsO4 за Мілонінгом. Матеріал зневоднювали та заключали у суміш епону та аралдиту згідно загальноприйнятих електронно-мікроскопічних методик. Після попередньої ідентифікації на напівтонких зрізах, забарвлених толуїдиновим синім, виготовлялися ультратонкі зрізи, які контрастували уранілацетатом та цитратом свинцю. Матеріал вивчався в електронному мікроскопі ПЕМ-125К та фотографували при збільшеннях 4 000 - 12 000 раз.
Отримані дані обробляли з використанням статистични