РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
ВИКОНАННЯ РОБОТИ
2.1. Методика та схеми проведення досліджень
Дослідження проводились у Науково-виробничому центрі з вивчення пріонних інфекції Інституту біології тварин УААН протягом 2002-2007 років. Матеріалом для досліджень була велика рогата худоба та лабораторні тварини (білі миші).
Відбір зразків від тварин проводили на Львівському м'ясопереробному підприємстві, приватному підприємстві "Інтеркомерс" с.м.т. Куликів Жовківського району Львівської області, підсобному господарстві АП "Шахта ім. Засядька" с. Олександрівка Слов'янського району Донецької області та господарстві СТоВ "Зоря" Ковельського району Волинської області. У плодів, телят та корів різного віку для досліджень відбирали кров, а після забою довгастий мозок, селезінку, нижньощелепові лімфатичні вузли, тонкий кишечник (дистальний відділ).
Для проведення досліду були сформовані групи тварин відповідного віку та породи. До першої групи тварин входили 6-8-місячні плоди, у другу - молодняк 10-15-місячного віку, у третю - 5-7-річні корови. Схема досліду представлена на рисунку 2.1.
Для вивчення етіологічних факторів розвитку пріонних хвороб нами проведено дослідження на лабораторних тваринах, білих мишах, які були аналогами за походженням та віком. З них сформували чотири групи - одну контрольну та три дослідні. У дослідних мишей вивчали зміну білкового складу тканин та органів за дії кормових чинників. Схема проведеного досліду представлена на рисунку 2.2.
Рис. 2.1 Схема та основні етапи проведення досліджень.
Рис. 2.2. Схема проведення досліду на лабораторних тваринах.
Раціон мишей, складався з гранульованої кормосуміші, яка застосовується для лабораторних тварин і є збалансованою за кількістю мікроелементів та вітамінів (табл. 2.1).
Мишам першої дослідної групи, крім основного раціону, згодовували тканину довгастого мозку великої рогатої худоби у кількості 50 мг кожній тварині на добу. Тваринам другої дослідної групи до основного раціону додавали м'ясо-кісткове борошно по 50 мг на голову в добу, в склад якого входили мікроелементи (33%), білки (30%), ліпіди (20%) та клітковина (10%). У третій дослідній групі до основного раціону щоденно додавали 25 мг тканини мозку корів та 25 мг м'ясо-кісткового борошна. Воду усім тваринам давали без обмежень.
Таблиця 2.1.
Кормосуміш для лабораторних тварин
Показники поживності Одиниці виміруКількістьСирий протеїнг/кг174,67Сирий жирг/кг33,55Сира клітковинаг/кг64,84Кальційг/кг6,29Фосфорг/кг6,02Магнійг/кг2,88Натрійг/кг0,54Лізинг/кг6,51Метіонінг/кг2,06Метіонін+цистинг/кг3,87Треонінг/кг5,33Віт. АМО/г6,0Віт. D3МО/г1,50Віт. Емг/кг5,00Віт. В1мг/кг0,50Віт. В2мг/кг2,50Віт. В3мг/кг5,00Віт. В6мг/кг1,00Віт. В12мкг/кг7,50Віт. В5мг/кг10,00Віт. В9мг/кг0,10Залізомг/кг20,60Мідьмг/кг2,51Цинкмг/кг25,03Марганецьмг/кг40,03Йодмг/кг0,50Кобальтмг/кг0,40Селенмг/кг0,15
Контрольні забої проводили через 360 діб. З кожної групи відбирали по 8 мишей для отримання крові та тканин мозку, селезінки, слизової оболонки тонкого відділу кишечнику. Досліджували вміст загального білка, розчинні білки шляхом електрофорезу у 7,5% ПААГ та 12,5% ДСН-ПААГ, активність ферментів аланін- та аспартатамінотрансфераз (АЛТ, АСТ).
2.2. Відбір і підготовка матеріалу для досліджень
Зразки проб крові у великої рогатої худоби відбирали з яремної вени. Кров мишей отримували після декапітації. Для отримання цільної крові та плазми у пробірки вносили 2-3 краплі 1% розчину гепарину, потім центрифугували протягом 20-ти хвилин при 1 тис. об/хв. Для отримання сироватки пробірки з цільною кров'ю витримували одну годину при температурі 37?С в термостаті ?34, 181?. Для виділення концентрату лейкоцитів у пробірку з 1 мл 3% NaEДTA вносили 4 мл венозної крові та обережно перемішували. У зв'язку з різною питомою вагою еритроцитів і лейкоцитів додавання трилону Б (NaEДTA) забезпечує розділення крові на дві фракції - еритроцити та плазму, яка містить велику кількість лейкоцитів. Пробірки інкубували 30-40 хвилин в термостаті при температурі 370С. Відсмоктували плазму і центрифугували при 1000 об/хв протягом 10 хвилин. Декантували, осад лейкоцитів розбавляли в 0,5 мл 0,05 М Тріс-буферу, рН 7,2 ?30, 182?.
Для дослідження мозку великої рогатої худоби зразки відбирали після забою спеціальною ложечкою через потиличний отвір в ділянці стовбура (довгастий мозок, зона засувки). Селезінку, нижньощелепові лімфатичні вузли та кишечник отримували після знекровлення та розділення туші.
У лабораторних тварин зразки відбирали після їх умертвіння. Умертвіння проводили шляхом декапітації під ефірним наркозом.
Відібрані зразки тканин (10-15 г) промивали 0,25 М розчином сахарози з 0,001М NaЕДТА (рН 7,4; 0+40С). Подріблену та промиту тканину гомогенізували протягом 30-40 хв. у гомогенізаторі Поттера з 3-5 мл 0,25 М сахарози у співвідношенні 1:10. Гомогенат центрифугували (600g; 10 хв). Супернатант, відділений від осаду, центрифугували при 14000g 10 хв. Надосадову рідину використовували для дослідження.
У крові та тканинах досліджували вміст загального білка, спектр розчинних білків та склад окремих фракцій, наявність і кількість білків з молекулярною масою 27-35 кДа.
2.3. Методи визначення біохімічних показників
2.3.1 Визначення вмісту загального білка у сироватці крові та тканинах досліджуваних органів. Вміст загального білка у сироватці крові визначали мікрометодом з біуретовим реактивом ?34, 181, 183?. Принцип методу грунтується на р