РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Загальна характеристика обстежених осіб
Під спостереженням протягом 2006-2008 рр. знаходилось 108 спортсменів, які займались бігом на середні дистанції (50 спортсменів мали масові розряди, а 58 були кандидатами та майстрами спорту), чоловічої статі у віці від 18 до 21 років. Контрольну групу склали 47 практично здорових нетренованих осіб у віці 18-21 років (чоловічої статі), які не займались спортом систематично.
Робота виконувалась у відповідності до загальноприйнятих біоетичних норм з дотриманням відповідних принципів Гельсінської декларації прав людини, Конвенції ради Європи про права людини і біомедицини та відповідних законів України відносно проведення експериментальних та клінічних досліджень. Всі спортсмени та особи, які не займались спортом систематично, дали згоду на обстеження та участь у випробовуваннях, цифрові результати яких увійшли до даного дисертаційного дослідження.
2.2. Методи досліджень та статистична обробка одержаних результатів
Дослідження впливу фізичних навантажень на віковий склад та метаболічний статус червонокрівців периферійної крові спортсменів проводили в змагальному періоді тренувального макроциклу. Дослідження здійснювали двічі: на початку змагального періоду та по його завершенні. Кров забирали ранком, натще, з пальця і з вени ліктьового згину. Дослідження проводили в науковій лабораторії кафедри патофізіології Луганського державного медичного університету (завідувач кафедри - професор Н.К. Казімірко).
У периферійній крові проводили підрахунок кількості червонокрівців (уніфікований метод підрахунку в лічильній камері, 1972) в 1 літрі, визначали гематокрит мікрометодом з використанням стандартних гепаринізованих капілярів.
Використовували відмиті ізотонічним розчином натрію хлорид червонокрівці (на 10 мкл гепарінизованої крові - 5 мл розчину натрію хлорид). Гемолізати отримували шляхом змішування 2 мл отриманої суспензії з 2 мл 0,002 М хлористоводневої кислоти на ізотонічному розчині натрію хлорид.
Кислотну резистентність червонокрівців визначали спектрофотометричним методом при довжині хвилі 720 нм. Кров розводили ізотонічним розчином натрію хлорид у співвідношенні 1:500, 3 мл розведеної крові змішували з рівним об'ємом розчину хлористоводневої кислоти на ізотонічному розчині натрію хлорид. Підвищення прозорості суспензії червонокрівців, яке відбувалось в процесі гемолізу, реєстрували кожні 30 секунд до постійної величини (у початковому періоді сферуляції червонокрівців - кожні 15 секунд для більш точного встановлення моменту початку гемолізу). Із отриманих даних складали еритрограми та підраховували показник стійкості червонокрівців [29]. При цьому враховували час сферуляції (точка початку гемолізу), час появи максимуму (на якій хвилині), час початку та закінчення гемолізу (у хвилинах та секундах), висоту максимуму (у відсотках червонокрівців, які розпались), кількість максимумів.
Для кількісного визначення вікових груп червонокрівців ми користувались отриманими еритрограмами. На еритрограмах визначали: (1) точку кінця сферуляції (відповідала початку кислотного гемолізу); (2) точку передмаксимуму гемолізу; (3) точку максимуму гемолізу; (4) точку постмаксимуму-1 гемолізу; (5) точку постмаксимуму-2 гемолізу; (6) точку кінця гемолізу. На графічному зображенні еритрограми визначали загальну площу фігури, використовуючи формули визначення площі прямокутника та трикутника. Приймали розраховану площу до кількості червонокрівців в 1 літрі крові. З часових точок (1-6) ламаної лінії опускали перпендикуляри на ось ординат та вираховували площі фігур між перпендикулярами. Площа кожної фігури відповідала частці червонокрівців певного віку. Розрахунок абсолютної кількості червонокрівців кожної вікової групи проводили за формулою: кількість червонокрівців=(А+В)/С, де А - загальна кількість червонокрівців (Т/л), В - площа фігури між перпендикулярами, С - загальна площа фігури, обчислена при визначенні еритрограми.
Для визначення інтенсивності процесів ПОЛ, стану системи АОЗ, вмісту аденозину фосфатів у різних вікових групах червонокрівців розробили наступний алгоритм. В спортсменів та нетренованих осіб забирали з пальця в об'ємі 0,02 мл. Кислотну резистентність червонокрівців визначали спектрофотометричним методом. Із отриманих даних складали еритрограми та підраховували показник стійкості червонокрівців. На еритрограмах визначали 6 точок, описаних вище. Для ізоляції клітин певної вікової групи з другої порції крові реакцію зупиняли в точці сферуляції, з третьої порції - в точці передмаксимуму, з четвертої - в точці максимуму, з п'ятої - в точці постмаксимуму-1, з шостої - в точці постмаксимуму-2. Реакцію зупиняли додаванням 3 мл 0,002 N розчину NaOH, який знаходився в центрифужній пробірці загальним обсягом 20 мл. Після зупинки реакції кислотного гемолізу червонокрівців пробірку негайно центрифугували при 1000 оборотах за хвилину протягом 1 хвилини. Після центрифугування забирали надосадову рідину, в якій визначали необхідні показники метаболізму червонокрівців.
Концентрація речовини між точками 1 та 2 буде дорівнювати різниці концентрацій цієї речовини на момент точок 2 та 1, і так далі для кожного з секторів. Для точки 3 концентрація складе: 3-(1+2), для точки 4: 4-(1+2+3), для точки 5: 5-(1+2+3+4).
Розрахунок концентрації метаболітів проводили з урахуванням кратності розведення вихідного об'єму крові: перше розведення (0,02 мл крові та 10 мл натрію хлорид) - в 500 раз, друге розведення (3 мл крові, розведеної в 500 раз, та 3 мл розчину хлористоводневої кислоти) - в 2 рази, третє розведення (6 мл крові з другого розведення та 3 мл розчину NaOH) - в 1,5 рази. А саме: отриманий результат спочатку помножуємо на 1,5, потім помножуємо на 2, і ще - на 500, що і буде відповідати об'єму крові 0,02 мл. Від отриманого результату віднімали значення відповідних метаболічних показників в сироватці крові (визначені