ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования
Под наблюдением находилось 118 спортсменов, занимающихся борьбой дзюдо, мужского пола, в возрасте от 18 до 20 лет (средний возраст - 19,2 года). Среди обследованных спортсменов массовые разряды имели 106 человек (89,8 %), кандидатов в мастера спорта и мастеров спорта было 12 человек (10,2 %). Тренировочный макроцикл включал 4 периода: (1) подготовительный длительностью 3 месяца, с частотой тренировок 3 раза в неделю по 2 часа каждая; (2) соревновательный длительностью 2-3 дня, с количеством спаррингов 2-6 за всё время соревнований; (3) переходный длительностью 10 дней с облегчёнными тренировками 2 раза в неделю; (4) дополнительный переходный период с облегчёнными тренировками 2 раза в неделю. Контрольную группу составили 57 практически здоровых нетренированных мужчин 18-20 лет. Работу выполняли с соблюдением всех положений биоэтики (Страсбург, 1985 год).
2.2. Методы исследования
Забор крови для иммунологических и биохимических исследований проводили в начале и в конце каждого периода. Для выделения лимфоцитов 15 мл крови брали из локтевой вены в пластиковые пробирки с антикоагулянтом (раствор гепарина + раствор Версена) после 15 минут пребывания обследуемого в состоянии покоя в положении сидя. Лимфоциты выделяли на градиенте плотности фиколла-верографина по модифицированной методике Boyum. Цельную кровь, разведенную в соотношении 1:1 средой 199, наслаивали на смесь фиколла-верографина и центрифугировали 20 минут при 500 g. Снятые интерфазные кольца мононуклеарных клеток дважды отмывали в течение 10 минут средой 199 [48, 69, 72, 75]. Затем ресуспендировали в полной питательной среде. Для подготовки суспензии лимфоцитов в концентрации 2*(9 lg)/л проводили расчет по формуле: В = (а/40-1)*с, где а - количество лимфоцитов в камере Горяева; с - количество суспензии клеток, оставленных в пробирке; В - количество фосфатно-буферного раствора, которое необходимо добавить. Использование описанного метода позволяет выделять из крови около 90 % лимфоцитов. Суправитальное окрашивание выделенных лимфоцитов трипановым синим свидетельствовало о жизнеспособности 98-99 % клеток.
Определение количества общих Т-лимфоцитов, Т-хелперов/индукторов, Т-супрессоров/цитотоксиков, натуральных киллеров и В-лимфоцитов проводили методом непрямой иммунной флуоресценции с использованием моноклональных антител, соответственно, CD3, CD4, CD8, CD16, CD22 производства научно-производственного центра "Медбиоспектр" (Москва, Российская Федерация) [119].
Определение ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, гамма-ИФН проводили в супернатантах лимфоцитов с помощью коммерческих наборов ELISA (Medgenix Diagnostics, Бельгия). Чувствительность составила 3 мг/л для всех тестов. Супернатанты были тщательно разведены в 4 раза перед тестированием, вследствие чего чувствительность составила 12 мг/л для разведенных проб. Эксперименты делали трижды и повторяли 4 раза с различными лимфоцитами доноров в различные дни. Для определения цитокинов использовали супернатанты культур лимфоцитов в концентрации 6 lg/мл.
Активность ФНО в надосадочных жидкостях лимфоцитов определяли модифицированным методом Ruff и Gilford. Клетки L-929 инкубировали при 37°С с плотностью 3•(5 lg) клеток в лунке в 96-луночных плоскодонных планшетах в среде 199 на растворе Хенкса с 10 % инактивированной сывороткой крупного рогатого скота до образования монослоя. После удаления культуральной среды вносили по 100 микролитров двукратных серийных разведений исследуемых образцов надосадочной жидкости и 100 микролитров свежей среды с актиномицином D (производства фирмы Sigma, США) в концентрации 2 мкг на лунку. Клетки инкубировали 18 часов в тех же условиях. Результаты реакции учитывали путём окрашивания выживших клеток кристалл-виолетом. Для этого в лунки панели заливали 0,2 % раствор кристалл-виолета (Sigma, США) в 2 % этаноле на 15 минут, промывали под проточной водой и высушивали. Оптическую плотность окрашенных клеток измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan (Великобритания) при длине волны 540 нанометров. В качестве стандарта использовали различные концентрации рекомбинантного ФНО-? и ФНО-? человека (Институт биоорганической химии РАН, Москва). Содержание ФНО в надосадочных жидкостях выражали в пг/мл.
Определение функциональной активности CD16+-клеток проводили фотоэлектрокалориметрическим методом по выходу гемоглобина из лизированных эритроцитов при длине волны 610 нм [57]. Для этого взвесь лимфоцитов в концентрации 2•6 lg/мл инкубировали в течение 18 часов при 37°С со взвесью эритроцитов человека группы крови АВ (IV) в концентрации 4•5 lg/мл. Соотношение "клетка-эффектор/клетка-мишень" составляло 50:1. Параллельно проводили контроль спонтанного лизиса эритроцитов (контроль). Далее определяли оптическую плотность (D) на фотоэлектрокалориметре в контроле (D контроль) и в опыте (D oпыт). Индекс цитотоксичности (ИЦ) высчитывали по формуле: ИЦ = (D опыт - D контроль)•100/D максимальная, где D максимальная - оптическая плотность при максимальном лизисе эритроцитов человека в концентрации 4•6 lg/мл.
Определение ДК ненасыщенных высших жирных кислот осуществляли по Стальной И.Д. (1977) [1, 9, 61]. Соединяли 0,2 мл лизата суспензии лимфоцитов в концентрации 6 lg клеток в 1 мл с 1,8 мл реактива (смесь гептана с изопропиловым спиртом в соотношении 1:1), и закрывали пробирки пробками, чтобы исключить выпаривание экстрагирующей фазы. Оставляли пробы на 15 минут, после чего центрифугировали при 6000 оборотах в минуту в течение 10-15 минут. Надосадочную жидкость переносили в градуированные пробирки, добавляли дистиллированную воду (1/10 часть супернатанта). После энергичного встряхивания и последующего распределения жидкости удаляли верхнюю гептановую фазу. К 0,5 мл этого раствора (опыт) и параллельно к 0,5 мл гептана (контроль) доливали по 2,5 мл метилового спирта и измеряли оптическую плотность