РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ, МОДЕЛЬ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Експериментальні дослідження виконані в лабораторії кафедри фармакології
ЛугДМУ, сертифікованої Державним фармакологічним центром (ДФЦ) МОЗ України
(посвідчення № 07 від 29 вересня 2005 р.) у повній відповідності з вимогами
Комісії з біоетики ЛугДМУ (протокол № 10 від 23 січня 2007 р.), а також
методичними рекомендаціями ДФЦ з доклінічного вивчення нових лікарських засобів
[205].
Досліди виконані на 324 білих безпородних статевозрілих щурах обох статей,
масою 190-220 р. Тварини перебували в умовах віварію ЛугДМУ і одержували
стандартну дієту у вигляді гранульованого корму за встановленими нормами.
Доступ до води був вільним. Евтаназію тварин здійснювали передозуванням
ефірного наркозу відповідно до вимог Комісії з біоетики ЛугДМУ.
Токсичний медикаментозний гепатит моделювали шляхом інтрагастраного введення
комбінації субстанцій засобів протитуберкульозної фармакотерапії: рифампіцину
(50 мг/кг) і ізоніазиду (86 мг/кг) у концентрації 2% на 2% крохмальній
суспензії, а також піразинаміду (1500 мг/кг) у концентрації 10% на 2%
крохмальній суспензії щодня протягом 28 днів [24, 180, 193, 206, 207].
Досліджуваний потенційний гепатопротектор МІГУ-2 і референтний препарат силібор
(виробництво ТОВ "Фармацевтична компанія "Здоров'я", м. Харків, Україна)
застосовували також перорально в дозах, відповідно, 100 мг/кг і 165 мг/кг у
вигляді 5% водної суспензії щодня протягом 28 днів через 1 годину після
введення туберкулостатиків.
Забій тварин здійснювали через 24 години після останнього введення
протитуберкульозних засобів і досліджуваних гепатопротекторів. Біосубстратами
для проведення комплексних біофізичних, біохімічних, а також фізико-хімічних
досліджень у рамках рішення поставлених у роботі задач, служили цільна кров,
сироватка крові та печінка, яку попередньо перфузували охолодженим
фізіологічним розчином. Гомогенат тканини печінки (концентрація 20%) готовили
на охолодженому (4°С) ізотонічному розчині натрію хлориду.
Інтегральним показником стану прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу в
організмі тварин з медикаментозним гепатитом обрана біохемілюмінісценція (БХЛ),
яку реєстрували на люмінометрі "Emіllіte - 1105" спільного
австро-німецько-російського виробництва в сироватці крові щурів протягом 5
хвилин. Спектральний діапазон приладу становить 350-390 нм, а діапазон вимірів
– 103-1010 фотон/с. Досліджуваний субстрат попередньо інкубували (20 хвилин при
37°С). Перед виміром записували фонові значення і спонтанний рівень БХЛ
протягом 1 хвилини. У роботі використаний удосконалений співробітниками кафедри
фармакології ЛугДМУ метод визначення в тканинах надслабкого світіння,
індукованого 3% розчином перекису водню [208].
Кінетику світіння оцінювали за наступними показниками: амплітудою швидкого
спалаху (І1), часом індукції повільного спалаху (ф), амплітудою повільного
спалаху (І2), амплітудою кінцевого значення БХЛ (ІК), а також загальною
світлосумою реакції (S). Розрахунок досліджуваних параметрів робили за
допомогою спеціально розробленої на кафедрі фармакології ЛугДМУ комп'ютерної
програми на базі процесора Іntel Pentіum-II-450MHz*
[* ) Висловлюємо подяку к.мед.н., доц. Д.С. Кравцу за надання допомоги з
комп'ютерної обробки експериментальних даних з БХЛ.]).
Стан процесів ПОЛ у тварин з медикаментозним гепатитом, спровокованим
туберкулостатиками, оцінювали за вмістом в крові і тканині печінки кінцевих
продуктів ліпідпереокислення, що реагують із 2-тіобарбітуровою кислотою
(ТБК-реактанти). В основі методу визначення вмісту ТБК-продуктов лежить їхня
здатність взаємодіяти з 2-тіобарбітуровою кислотою в кислому середовищі при
температурі кипіння води, у результаті чого утворюється пофарбований
триметиновий комплекс із максимумом поглинання при довжині хвилі 540 нм.
Розрахунок вмісту даного продукту липідпереокислення здійснювався з
використанням коефіцієнта молярної екстинкції 1,56·105 М-1 см-1 [209].
Стан основних компонентів АОС захисту організму оцінювали за активністю двох
ключових ферментів її ензимної ланки – СОД і каталази, а також за рівнем
компонентів неферментативної ланки – відновленого глутатіону і вільних
SH-груп.
Активність СОД вивчали у сироватці крові за методом [210], заснованим на
інгібуванні даним ферментом реакції окислення кверцетину з максимумом
поглинання при довжині хвилі 406 нм.
В основі методу визначення каталази лежить її здатність розкладати молекули
перекису водню на кисень і воду. Невитрачений перекис водню утворює із солями
молібдену стійкий пофарбований комплекс із максимумом поглинання при довжині
хвилі 410 нм [211].
Визначення рівня сульфгідрильних груп у крові проводили за методом G.L. Ellman
[212], принцип якого заснований на реакції утворення дисульфідних зв'язків у
присутності реагенту – 5,5'-дитіобіс-2-нітробензойної кислоти (ДТНБК). При
цьому утворюється досить стійкий пофарбований комплекс – тіонітрофільний аніон,
рівень якого оцінювали за величиною зміни оптичної щільності при л=412 нм.
Вміст відновленого глутатіону в крові визначали за реакцією SH-груп останнього
із ДТНБК з утворенням пофарбованого продукту, що ідентифікується по зміні
оптичної щільності при довжині хвилі 400 нм [213].
Забезпеченість організму тварин у досліджуваних умовах експерименту ендогенними
антиоксидантами оцінювали за інтегральним показником стану перекисної
резистентності еритроцитів (ПРЕ) [214].
З метою більш коректного судження про ефективність МІГУ-2 у плані його
здатності протистояти окисному стресу при токсичному медикаментозному геп
- Київ+380960830922