РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Об’єкт дослідження та умови культивування і зберігання культур пурпурових
сіркобактерій
У роботі використано пурпурових сіркових бактерій, виділених нами з озера
"Яворівське" Язівського сіркового родовища (Україна) та ідентифіковані як -
Thiocystis sp. Ya2006, Chromatium sp. Ya2006-1, Chromatium sp. Ya2006-2 (власні
ізоляти); а також Thiocapsa sp. YT1001, з колекції культур кафедри
мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка [207].
Культури вирощували в рідкому або на агаризованому середовищі Ван Ніля [208]
(г/л): NH4Cl - 1; KH2PO4 - 1; MgCl2?6H2O - 0,5; NaCl – 5; NaHCO3 – 5; Na2S?9H2O
– 1, агар - 15. Крім середовища Ван Ніля у ряді експериментів для культивування
бактерій використовували:
Середовище Шлегеля (г/л): (NH4)2SO4 - 1; KH2PO4 - 1; KCl - 0,5; MgSO4?7H2O - 1;
CaSO4?2H2O - 0,5; NaHCO3 – 5; Na2S?9H2O – 1 [208];
Середовище Ларсена 9 (г/л): NH4Cl - 1; KH2PO4 - 1; СaCl2 - 0,1; MgCl2?6H2O -
0,5; NaCl - 2; NaHCO3 – 5; Na2S?9H2O – 1 [208];
Середовище Пфенніга (г/л): NH4Cl - 0,34; KH2PO4 - 0,34; СaCl2 2H2O - 0,25; KCl
- 0,34; MgSO4·7Н2О - 0,5; NaHCO3 – 1,5; Na2S?9H2O – 0,5 [208];
Середовище АТСС №1449 (г/л): NH4Cl - 0,4; KH2PO4 - 0,5; СaCl2 2H2O - 0,05;
MgSO4·7Н2О - 0,2; NaHCO3 – 2; Na2S?9H2O – 0,5 [209].
Розчини (10 %) NaHCO3 i Na2S?9H2O готували і стерилізували окремо. Концентрація
ацетату натрію в середовищах складала 0,05 %.
Вітамін В12 в поживні середовища додавали в кількості 5 мкг/л. Використовували
розчин мікроелементів, який додавали в кількості 1 мл на 1 л середовища. Розчин
мікроелементів мав такий склад (г/л): етилендіамінтетраоцтова кислота - 5,2;
FeCl2?4H2O - 1,5; ZnCl2 - 0,07; MnCl2?4H2O; H3BO3 - 0,006; CoCl2?6H2O - 0,190;
CuCl2?2H2O - 0,002; NiCl2?6H2O - 0,025; Na2MoO4?2H2O - 0,188; Na2SeO3 - 0,002.
рН середовища доводили 10% Н3РО4 до значення 7,0.
Для культивування бактерій в анаеробних умовах використовували анаеростати
(GENbox jars, bioMerieux, Франція) із кисеньпоглинаючими генераторами (GENbox
generators, bioMerieux, Франція). На рідкому середовищі культури вирощували у
пробірках об’ємом 20 мл, які закривали гумовими корками так, щоб не залишалося
міхурців повітря. Розчиненого у рідкому середовищі кисню, позбувалися шляхом
кип’ятіння з наступним швидким охолодженням середовища. Кількість інокуляту,
якщо не вказано інакше, - 0,4 г/л. Тривалість культивування 10 діб при
температурі 28 єС за умов постійного освітлення.
Джерелом світла слугували лампи розжарювання різної потужності. Інтенсивність
освітлення вимірювали люксометром Ю116. Її регулювали зміною відстані між
джерелом світла і об’єктом дослідження. У ряді експериментів використовували
лампи розжарювання з пониженою напругою живлення.
Культури зберігали у агаризованому середовищі Ван Ніля у 20-мл пробірках при
температурі 20оС та постійному освітленні інтенсивністю 50 - 100 лк.
2.2. Отримання нагромаджувальних і чистих культур пурпурових сіркобактерій
Для отримання нагромаджувальних культур пурпурових сіркобактерій у високі
скляні циліндри або у пробірки об’ємом 50 мл, заповнені мінеральним середовищем
Ван Ніля, вносили зразки води або мулу у кількості 1 - 5 % від об’єму [210]. На
дно посудини поміщали гіпс. Для створення селективних умов для розвитку
невеликих або великих за розміром видів Chromatiaceae нагромаджувальні культури
вирощували за умов різної освітленості (50 - 300 лк або 500 - 1000 лк) та
температури (20 - 25 єС або 30 - 35 єС) [3]. Через кожні сім діб до середовища
вносили стерильний розчин Na2S. Для збільшення кількості пурпурових сіркових
бактерій, бактерії із зони росту, що мала червоне забарвлення, пересівали два -
три рази в аналогічне середовище.
Чисті культури пурпурових сіркобактерій виділяли за методом Ван Ніля [211].
Стерильне агаризоване середовище перед посівом розплавляли, охолоджували
приблизно до 45 ?С, додавали NaHCO3 і Na2S, рН середовища доводили до 7,5 і
швидко розливали у пробірки. Висота стовпчика агаризованого середовища складала
приблизно 8 см. Вносили 0,1 мл із червоної зони нагромаджувальних культур,
перемішували і пересівали у наступні пробірки до кінцевого розведення 1 млн
разів. Стовпчики агару заливали сумішшю парафіну і вазеліну, щоб попередити
проникнення в середовище кисню, і поміщали в термостат при 20 - 25? С і
освітленості інтенсивністю 500 - 1000 лк. Окремі колонії пурпурових сіркових
бактерій, що виросли в товщі агару, переносили на чашки Петрі з агаризованим
середовищем. З чашок відбирали окремі колонії і клоновували їх 4 - 5 разів.
Чисті культури, одержані таким чином, додатково перевіряли на чистоту
мікроскопуванням та шляхом висіву на МПА, сусло і на середовище
Кравцова-Сорокіна для сульфатвідновлювальних бактерій [212].
2.3. Ідентифікація отриманих культур пурпурових сіркових бактерій
Ідентифікацію виділених культур до роду проводили на основі морфо-фізіологічних
ознак [213] згідно нових стандартів для опису фототрофних бактерій [214].
Форму, розмір клітин, здатність утворювати агрегати, капсули, спори, газові
везикули, сірку вивчали стандартними методами за допомогою світлової
мікроскопії.
Для вивчення здатності бактерій засвоювати органічні речовини, останні вносили
до середовища у концентрації 0,5 мМ [214]. Для дослідження здатності бактерій
використовувати сполуки сірки як донори електронів, проводили їх висів на
середовища з сульфідом натрію (Na2S, 0,5 - 40 мМ), елементною сіркою (S8, 0,1
%), тіосульфатом натрію (Na2S2O3, 5 мМ), сульфітом натрію (Na2SO3, 5 мМ) згідно
стандартним рекомендаціям [214]. Здатність використовувати різні джерела азоту
та визначення оптимальних для росту температури, значення рН вивчали у рідкому
середовищі Ва
- Київ+380960830922