РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Експериментальна частина досліджень виконана в господарствах Черкаської області
та на головному племпідприємстві ВАТ „НВО Прогрес». Вікову динаміку кількісних
та якісних показників спермопродукції бугаїв-плідників різних порід вивчали за
матеріалами зоотехнічного обліку та досліджень, здійснених у лабораторії
технології одержання і кріоконсервації сперми Черкаського ВАТ „НВО Прогрес»
згідно з ГОСТ 20909.3-75 – ГОСТ 20909.6-75 та ГОСТ 27777-88 (Ст. СЭВ. 5961-87).
Годівлю проводили за нормами ВІТа. Дослідження проведені за період з 1999 по
2005 роки відповідно до вищенаведеної загальної схеми (мал. 2.1).
Об’єктом досліджень були дорослі бугаї-плідники віком від 2 до 9 років чотирьох
порід в кількості 283 голови, (симентальської (n=65), голштинської (n=113),
української червоно-рябої молочної (n=93) та української чорно-рябої молочної
(n=12)) які утримувалися в типових умовах ВАТ „НВО Прогрес” Черкаської області.
За дослідний період умови годівлі та утримання не зазнавали значних змін.
Сперму одержували з допомогою штучної вагіни два рази на тиждень шляхом
дуплетної садки.
При вивченні спермопродуктивності бугаїв-плідників враховувалися такі показники
як кількість отриманих еякулятів за рік, середній об’єм, концентрація, загальна
кількість сперміїв в еякуляті, вихід якісних спермодоз та інші згідно
загальноприйнятих методик [6, 72, 83, 103, 133, 136, 216, 244]. Із факторів,
які могли б вплинути на продуктивність та тривалість господарського
використання, нами було вивчено:
генетичні:
- порода;
- лінія, споріднена група;
- “кровність” за голштинською породою;
- походження плідників;
та паратипові:
- сезон взяття сперми;
- вік плідника.
Отриманий еякулят зважували на електронних вагах при переведенні його в об’ємні
одиниці застосовували коефіцієнт 1. Концентрацію визначали за допомогою
цифрового фотометру СДМ-30, виробництва фірми „Мінітюб”. В подальшому процесі
технологічної обробки кріоконсервація сперми проводилася в двох формах –
відкрита гранула та в формі паєт – „Мінітюб” – 0,25 мл. При застосуванні форми
відкритої гранули використовували лактозо-гліцерино-жовточний розчинник, який
добавляли в залежності від концентрації згідно таблиці розведення. Після
10-хвилинної експозиції при кімнатній температурі розбавлену сперму переносили
в холодильник при температурі
+ 4±0,5?С на 2,5-4 години для еквілібрації. Процес заморожування проводили в
парах рідкого азоту на фторопластових пластинах.
При виготовленні спермопродукції в вигляді паєт „Мінітюб” - 0,25 мл для
розбавлення використовували розчинник „Триладил”, до складу якого входять:
фруктоза, трис, гліцерил та жовток курячого яйця. Розведення сперми проводили
згідно комп’ютерної програми IDA (Мінітюб). Після розфасовки сперми в соломинки
її поміщалися в контейнери і переносилися для еквілібрації в холодильну камеру
на 2,5-4 години. Процес заморожування проводився в програмному заморожувані при
температурі 120? С на протязі 10 хвилин, після чого сперма переносилася в
рідкий азот для тривалого зберігання. Ці технологічні прийоми кріоконсервації
сперми проводилися одночасно на протязі одного року для оцінених
бугаїв-плідників з метою вивчення впливу технологічної обробки на результати
зберігання спермопродукції.
Запліднювальну здатність визначали на поголів’ї корів (n=987238) в
господарствах Черкаської області за кінцевим результатом. Запліднювальну
здатність сперміїв в залежності від морфологічних характеристик сперматозоїдів
вивчали в племінних господарствах Золотоніського р-ну – агрофірмі „Маяк” та ПСП
„Плешканівське” (n=300), за результатами не приходу самок в охоту на протязі 60
діб.
З морфологічних показників еякуляту визначали кількість атипових форм клітин та
ступінь конденсації хроматину в головці сперматозоїду. Всього проаналізовано
786 еякулятів на протязі 1 року.
При визначенні кількості морфологічно-змінених форм готували мазки нативної та
заморожено-розмороженої сперми. Попередньо сперму розводили у 100 разів в 2,9 %
розчині цитрату натрію, після чого мазки підсушували та фіксували в 3 % розчині
глутарового альдегіда на 0,2 М фосфатному буфері
(рН =7,2) при експозиції 30 хв. В подальшому проводили фазово-контрастну
мікроскопію нефарбованих мазків (з метою зниження кількості артефактів в
наслідок фарбування) при збільшенні в 400-600 разів, нараховуючи 200 клітин.
Класифікували патологічні сперматозоїди в залежності від місця локалізації
пошкодження – аномалії головки, пошкодження в ділянці шийки та хвоста,
ізольовані головки. Окремо виділяли молоді форми за наявністю протоплазматичної
краплини [235]. Згідно схеми [293] :
При визначенні патологічних форм сперматозоїдів в еякуляті використовували такі
показники [2]:
Вміст патологічних форм сперматозоїдів в відсотках:
Індекс патології:
де р - кількість морфологічно-змінених сперміїв,
N – кількість нормальних сперматозоїдів.
При визначенні хроматинового статусу сперматозоїдів використовували методику,
описану M.E. Hammadeh et al. [270], Courtens J.L. [267], Januskauskas A.
[268].
Швидкість та параметри руху сперматозоїдів визначали за допомогою програмного
забезпечення SpermVision німецької фірми «Minitub». Принцип роботи якого
побудований на комп’ютерному аналізі цифрового зображення з високошвидкісної
цифрової відеокамери. Показники оцінки стандартизовані у відповідності з
рекомендаціями Всесвітньої організації охорони здоров’я. При цьому рухові
характеристики визначаються по 13 параметрах.
Стійкість сперматозоїдів до заморожування визначали за відсотком вибракуваних
спермодоз після проведення тех