РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследования
В настоящей работе в качестве модельных объектов исследований использовали
следующие виды:
из Cyanophyceae - Spirulina platensis (штамм IBBS – 31),
из Chlorophyceae – Dunaliella salina (штамм IBBS – 4).
Апробацию разработанных методов перевода в состояние ангидробиоза и выведения
из него провели на трёх видах микроводорослей, относящихся к разным
таксономическим классам:
из Cyanophyceae - Synechococcus elongatus (штамм IBBS – 36),
из Rhodophyceae - Porphyridium cruentum (штамм IBBS – 70),
из Bacillariophyceae - Phaeodactylum tricornutum (штамм IBBS – 40).
Dunaliella salina, Spirulina platensis, Synechococcus elongatus, и
Phaeodactylum tricornutum взяты из коллекции культур отдела биотехнологии и
фиторесурсов Института биологии южных морей (ИнБЮМ), красные водоросли
Porphyridium cruentum – из коллекции культур отдела экологической физиологии
водорослей. Подробное описание объектов исследований – Dunaliella salina
приводится в работах [22, 55], Spirulina platensis [20, 211], Synechococcus
elongatus, Phaeodactylum tricornutum [27] и Porphyridium cruentum [27].
Цианопрокариоты выращивали на среде Zarouk [128], зелёные — на среде Ben-Amotz
[190], диатомовые и красные – на среде Тренкеншу [76]. Прописи питательных сред
приведены в табл. 2.1. Для приготовления сред, использовали реактивы
квалификации х.ч. и ч.д.а.
Таблица 2.1
Питательные среды для культивирования микроводорослей
Среда Ben-Amotz
Среда Тренкеншу1
Среда Zarouk
Компоненты
г/л
Компоненты
г/л
Компоненты
г/л
NaCl
45
NaNO3
1.2
NaHCO3
16.8
KNO3
0.505
NaH2PO4*2H2O
0.45
K2HPO4
0.5
KH2PO4 * 3H2O
0.038
Na2 EDTA
0.037
NaNO3
2.5
Na2 EDTA
0.04
FeC6H5O7*3H2O
0/0265
K2SO4 (KCl)
NaHCO3
4.2
Микроэлементы:
NaCl (Na2SO4)
Микроэлементы:
г/л
KCr2(SO4)4*24H2O
0.0017
MgSO4 * 7H2O
0.2
FeCl3 * 6H2O
0.00054
(NH4)6Mo7O24*4H2O
0.0009
CaCl2
0.04
MnCl2 * 4H2O
0.0001
Co(NO3)2*6H2O
0.0031
FeSO4
0.01
CuCl2 * H2O
0.0001
MnCl2*4H2O
0.004
EDTA
0.08
ZnCl2 * H2O
0.0001
Микроэлементы:
г/л
CoCl2 * 6H2O
0.0001
H3BO3
2.86
(NH4)6Mo7O24 * 4H2O
0.001236
MnCl2
1.81
ZnSO4 * 7H2O
0.22
CuSO4 * 5H2O
0.015
NH4VO
0.229
CoCl2
0.044
K2Cr2SO4
0.096
1 Для приготовления среды Тренкеншу используется морская вода, для среды Zarouk
и Ben-Amotz ѕ дистиллированная вода
Культиваторами для выращивания Spirulina platensis служили стеклянные стаканы
объёмом 2 дм3 и ванны объёмом 200 дм3, объём среды в которых составлял 1 дм3 и
120 дм3 соответственно, при высоте слоя 14 – 15 и 7 – 8 см. Spirulina platensis
выращивали методом накопительной культуры в условиях круглосуточного освещения
при температуре 20 – 25°С. Интенсивность освещения, создаваемая лампой ДРЛ-400,
в разных точках на поверхности суспензии в среднем составляла 10,7 кЛк.
Измерение проводили по методике, описанной в работе [82]. Для удаления избытка
кислорода в среде и равномерного прогрева суспензии культуру в течение суток
перемешивали с помощью насоса.
Культуры микроводорослей Dunaliella salina, Phaeodactylum tricornutum,
Synechococcus elongatus, Porphyridium cruentum выращивали методом накопительной
культуры в стеклянных стаканах объёмом 2 дм3 и фотобиореакторах, конструкция
которого подробно описана в [30]. Процесс выращивания Porphyridium cruentum
сопровождался непрерывным снабжением газовоздушной смесью с концентрацией
углекислоты, обеспечивающей оптимальную рН среды (8 – 9 ед.). Освещённость
рабочей поверхности культиваторов в среднем составляла 8 кЛк, температура – 26
– 28°С. Равномерное перемешивание суспензии водорослей осуществлялось
посредством барботирования воздуха с помощью компрессорной установки (0,5 л
воздуха на 1 л культуры в 1 мин). Для компенсации испарения ежедневно добавляли
воду до установленной на культиваторе метки.
Концентрирование трихом Spirulina platensis проводили путем их фильтрации через
мельничный газ 100 – 105 ПЭ [183], клеток Dunaliella salina, Phaeodactylum
tricornutum, Synechococcus elongatus, Porphyridium cruentum –
центрифугированием на лабораторной центрифуге ОПН–3-УХЛ 42 при 3000 об./ мин.
Сконцентрированную культуру Spirulina platensis промывали дистиллированной
водой в соотношении 1: 3 (вода: клетки), остальных водорослей - изотоническим
раствором углекислого аммония [28] для полного отмывания от солей и сохранения
клеточных мембран и оболочек. Затем полученную пасту водорослей разделяли на
три части и высушивали до воздушно-сухого состояния в термостате: Dunaliella
salina при температурах 30, 45 и 60°С, все остальные водоросли при 30, 60 и
70°С. Продолжительность обезвоживания 24 ч.
Обезвоженные клетки микроводорослей хранили в герметично закрытых
полиэтиленовых упаковках, в темноте при температуре 15–20°С.
2.2. Методы
Интенсивность освещения на поверхности культуры регистрировали при помощи
люксметра Ю-116, рН среды определяли иономером ЭВ-74.
Рост культур регистрировали фотометрическим методом по оптической плотности
суспензии водорослей в области 750 нм (D750), измеряемой на
фотоэлектроколориметре КФК-2 в кюветах с рабочей длиной поверхности 5 мм. Для
этого ежедневно в одно и то же время объём культуры доводили до первоначального
объёма водой (для компенсации испарения), суспензию тщательно перемешивали и
отбирали несколько проб по периметру культиватора и в центре до общего объема 3
см3. Затем брали среднюю порцию (0,5 см3), а остальную часть возвращали в
культиватор.
Содержание сухой массы (СМ) определяли расчетным методом по уравнению
регрессии. Переход от единиц оптической плотности (D750) к
- Київ+380960830922