РОЗДІЛ 2
СХЕМА, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Схема дослідження
Було проведено дві серії дослідів на курчатах-бройлерах кросу „Кобб-500” у
дослідному господарстві „Борки” НДІ птахівництва УААН. Для проведення першої
серії досліджень було сформовано п’ять груп добових курчат по 50 голів у
кожній. Птиця утримувалась у клітковій батареї при дотриманні нормативних
технологічних параметрів [64, 85]. Експерименти проводили відповідно до вимог
„Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в
експериментах та інших наукових цілях”.
Досліди проводили за схемою: I група – контрольна, курчата цієї групи
одержували стандартний комбікорм: кукурудза – 19 %, пшениця – 50 %, шрот соєвий
– 13 %, рибне борошно – 6,5 %, дріжджі гідролізні – 5 %, трав’яне борошно – 4,5
%, крейда – 1 %, премікс – 1 %. Починаючи з 10-добового віку, в раціон птиці
II, III, IV груп вводили добавку „Гумісол” (як джерело гумінових кислот) в дозі
20 мл, 60 мл та 80 мл на 1 кг корму відповідно, а курчатам V групи з кормом
згодовували кормову добавку „Вітадепс” (як джерело каротину) в дозі 2,7 г/кг
корму.
Вивчення активності ферментів гліколізу, циклу трикарбонових кислот (ЦТК) та
тканинного дихання проводили в клітинах печінки та підшлункової залози, як в
органах, що безпосередньо беруть участь в процесах травлення. Тому вивчення їх
енергетичного потенціалу було актуальним, особливо у присутності кормових
добавок.
Забій птиці для проведення біохімічних досліджень проводили на 9, 25, 35 і 45
добу вирощування (з кожної групи відбирали по 6 голів). Для вивчення реакцій
тканинного дихання, окисного фосфорилування та активності дегідрогеназ ЦТК
використовували препарати мітохондрій печінки та підшлункової залози, а для
визначення активності ферментів гліколізу – гомогенати цих органів.
Другу серію досліджень було проведено з метою визначення основних зоотехнічних
показників: продуктивності, збереженості поголів’я, конверсії кормів. Для цього
було сформовано групи птиці, аналогічні як для першого досліду, по 100 голів у
кожній.
2.2. Матеріали і методи дослідження
Для виконання поставлених в роботі задач використовували препарати мітохондрій
печінки і підшлункової залози та гомогенати цих органів.
2.2.1. Виділення мітохондрій. Мітохондрії з печінки і панкреасу виділяли
методом диференційного центрифугування, на центрифузі К 24 (Німеччина) (D.
Jonson, H. Lardy, 1967) [17].
Після забою птиці вилучали досліджувані органи, переносили в спеціальне
охолоджене середовище виділення (рН = 7,2), швидко охолоджували і промивали від
крові. Від кожного органа відбирали шматочки масою 3 г, поміщали в ричажний
прес і продавлювали в гомогенізатор, де знаходилося 18 мл середовища виділення,
що містило 0,25 М сахарозу, 5 мМ тріс-НСl та 1 мМ етилендиамінтетраацетату.
Гомогенізацію здійснювали в скляному гомогенізаторі з тефлоновим пестиком
протягом 20-30 с. При цьому пестик опускали і підіймали 2-3 рази з постійною
швидкістю обертання 600 об/хв. Одержаний гомогенат переносили в центрифужні
пробірки. Перше центрифугування проводили зі швидкістю 600 g протягом 10
хвилин. Надосадову рідину зливали і відбирали 0,5 мл одержаного супернатанту
для визначення активності ферментів гліколізу. Рідину, що залишилася,
центрифугували ще 10 хвилин при 10000 g. Осад мітохондрій промивали двічі
середовищем виділення. Для одержання гомогенної наважки мітохондрій
використовували скляний ручний гомогенізатор. Всі маніпуляції проводили на
холоді (при температурі 0 – +4оС), з використанням охолоджених розчинів та
інструментів. Пробірки із суспензією мітохондрій переносили в ємність із льодом
та зберігали не більше двох годин. Суспензію використовували для визначення
активності ферментів, а мітохондрії гепатоцитів ще й для полярографічних
досліджень тканинного дихання.
2.2.2. Визначення активності ферментів гліколізу та тканинного дихання. У
гомогенатах печінки та панкреасу визначали активність ферментів: 1)
фосфофруктокінази (КФ 2.7.1.11), альдолази ( КФ 4.1.2.7); в суспензії
мітохондрій – активність: 1) б-кетоглутаратдегідрогенази (КФ 1.2.4.2), 2)
сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1), 3) малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37), 4)
цитохромоксидази (КФ 1.9.3.1), Mg2+-залежної АТФ-ази (КФ 3.6.1.3). Для
розрахунків активності ферментів концентрацію білка в суспензії мітохондрій та
гомогенатах визначали методом О. Лоурі (1951) та співавт. [17].
Визначення активності фосфофруктокінази (ФФК). Активність ФФК визначали методом
за прописом Курило Ю. Г. (1979) з деякими модифікаціями [17]. В якості
субстрату використовували натрієву сіль фруктозо-6-фосфату, що при дії ферменту
перетворюється у фруктозо-1,6-дифосфат. У присутності в середовищі альдолази,
фруктозо-1,6-дифосфат розщеплюється на фосфотріози. Кількість диоксиацетону
визначали по кольоровій реакції з 2,4-динітрофенілгідразином.
До складу середовища інкубації для визначення ФФК входить: тріс-буфер (0,05 М),
гідразинсульфат натрію (0,14 М), метабісульфіт натрію (0,03 М), хлорид магнію
(0,1 М), АТФ, розчин фруктозо-6-фосфату (0,06 М), при рН = 7,8.
В пробірки вносили по 0,75 мл інкубаційного середовища та 0,05 мл гомогенату,
інкубували зразки протягом 30 хвилин при 41оС в термостаті. Після цього проби
охолоджували і додавали по 0,1 мл 10% розчину трихлороцтової кислоти і залишали
на 20 хвилин в холодильнику; суміш центрифугували, осад відкидали. Відбирали по
0,5 мл надосадової рідини і додавали по 0,37 мл 0,75 н розчину гідроксиду
натрію, через 10 хвилин додавали по 0,5 мл 2,4-динітрофенілгідразину і
розміщували в термостаті при 40оС на 10 хвилин. Після цього додавали по 2,5 мл
0,75 н роз
- Київ+380960830922