РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Особливості методології дослідження
і методи обстеження вагітних і новонароджених
Робота була виконана протягом 2003-2007 рр. на кафедрі акушерства, гінекології
та перинатології ФІПО Донецького національного медичного університету ім. М.
Горького (зав. кафедрою – член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук,
професор В.К.Чайка) і в Кременчуцькому міському пологовому будинку Полтавської
області (головний лікар – заслужений лікар України Я.Д. Прокопчук). Лабораторні
дослідження проводилися в імунологічній лабораторії Кременчуцького міського
пологового будинку й імунологічній лабораторії Кременчуцької обласної станції
переливання крові (головний лікар – Т.М. Бурова).
Для рішення поставлених задач і досягнення мети нами була складена програма
дослідження, яка включала 4 етапи (рис. 2.1).
На першому етапі дослідження був проведений ретроспективний аналіз 3000
обмінних карт і історій пологів за 2000-2005 рр. методом загальної вибірки з
метою виявлення частоти ізоімунізації за системою АВ0, а також детальний аналіз
420 історій пологів жінок з ізоімунізацією за системою АВ0 з метою визначення
факторів ризику, що впливають на розвиток і тяжкість ГХН.
На другому етапі проводилося проспективное вивчення імунного статусу у 101
жінки з ізоімунізацією різного ступеня тяжкості та стану їх внутрішньоутробних
плодів. Досліджувані вагітні були розділені на 3 клінічні групи в залежності
від ступеня тяжкості ізоімунізації.
Рис. 2.1. Програма і дизайн дослідження
Оцінку ступеня ізоімунізації проводили на підставі даних обстеження на
гемолізини, а також імунні повні й неповні антитіла.
Встановлення ступеня тяжкості ізоімунізації за системою АВ0 проводили за
наступними критеріями:
слабкий ступінь ізоімунізації: імунні повні антитіла відсутні, імунні неповні
антитіла (++);
середній ступінь ізоімунізації: імунні повні антитіла (+), імунні неповні
антитіла (+++);
тяжкий ступінь ізоімунізації: імунні повні антитіла (+++), імунні неповні
антитіла (++++).
На третьому етапі дослідження була розроблена і впроваджена тактика ведення
вагітності й пологів у жінок з ізоімунізацією за АВ0 середнього і тяжкого
ступеня і проведена оцінка її ефективності, для чого жінки були розділені на
наступні групи: у I групі (основній, n=92) до комплексу лікування додатково був
включений плазмаферез; II група (порівняння, n=86) одержувала загальноприйняте
лікування; III група (контрольна, n=50) – вагітні з 0(I) групою крові без
ізоімунізації. Також були розроблені і впроваджені в практику методики
діагностики і лікування тяжкої форми ГХН. Усі немовлята з тяжкою формою ГХН
(n=52) були розділені на 2 групи. Основну групу IНПА склали 25 немовлят, яким у
комплексне лікування був включений дискретний ПА. До групи порівняння (ІІ НЗПК)
увійшли 27 дітей, яким у комплексному лікуванні тяжкої форми ГХН проводилося
замінне переливання крові.
На четвертому етапі були оцінені клінічна й економічна ефективність
запропонованого лікувально-профілактичного комплексу у жінок з наявністю
ізоімунної вагітності за системою АВ0 і у новонароджених з ГХН тяжкого
ступеня.
Обстеження вагітних з ізоімунізацією за системою АВ0 ми проводили згідно з
наказом МОЗ України № 676 від 31.12.2004 р.. Крім того, ми вивчали також
імунологічний статус вагітних і обстежували немовлят за допомогою прямої проби
Кумбса з використанням гелевої технології.
Нами досліджені деякі показники клітинної і гуморальної ланок імунітету у
вагітних з ізоімунізацією за системою АВ0. Стан клітинної ланки імунітету в
сироватці крові пацієнток вивчали шляхом визначення популяційного рівня
загальних Т-клітин (CD 3+) і їх субпопуляційного складу (CD 4+, CD 8+), а також
В-клітин (CD 22+) за допомогою відповідних тест-систем моноклональних антитіл у
реакції прямої люмінісценції [21].
Про стан гуморальної ланки імунітету судили за рівнем імуноглобулінів Ig G, A і
M, які визначали методом G. Mancini et al. (1965). Рівень циркулюючих імунних
комплексів (ЦІК) у сироватці крові визначали методом осадження
поліетіленгліколя [32].
Діагностика ізоімунної вагітності ґрунтувалася на визначенні імунних анти-А й
анти-В антитіл у периферичній крові жінок, проведенні прямої проби Кумбса у
новонароджених.
Визначення імунних аглютинінів за допомогою гелевої технології
Гелева технологія в мікропробірках була запропонована Y. Lapierre у 1989 році.
Метод заснований на проведенні реакції аглютинації еритроцитів у твердофазному
середовищі – агаровому гелі «Сефадекс», поміщеному в мікропробірки з наступним
центрифугуванням (патент DiaMed AG, Швейцарія). Ідентифікаційні картки
(ID-картки) DiaMed являють собою пластикові картки, у які вбудовано по шість
мікропробірок, що містять нейтральний гель або суміш гелю й антисироватки.
Маркування пробірок у ID-картці здійснюється за виявленими антигенами.
Взаємодіють антитіла з антигенами еритроцитів у гелевому тесті у верхній
частині мікропробірки, при центрифугуванні відбувається розподіл аглютинованих
клітин від неаглютинованих. Неаглютиновані еритроцити мають розмір, порівняний
з розміром часточок гелю, і вільно проходять через його товщину під дією
відцентрової сили, осідають на дні пробірки, утворюючи зсідок червоного кольору
– це негативний результат. Аглютиновані еритроцити мають більший розмір у
порівнянні з часточками гелю і затримуються на його поверхні або в його товщі –
це позитивний результат.
Гелевий тест, особливо коли гель не нейтральний, а містить у собі специфічні
реагенти, є більш чутливим при визначенні й ідентифікації клінічно значимих
антитіл. Перевагою