РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ
2.1. Характеристика досліджуваного матеріалу.
Для вирішення поставлених завдань досліджували слинні та підшлункову залози тварин у порівняльно-видовому аспекті, а також аутопсійний і біопсійний матеріал слинних і підшлункової залоз в нормі і патологічних процесах (змішаних пухлинних), а також слизову оболонку ясен в нормі і при пародонтитах, тонку кишку, товсту кишку в нормі і при хворобі Гіршпрунга, аутопсійний матеріал кори головного мозку в нормі і при менінгоенцефалітах, плаценту людини в нормі і слабості родової діяльності (СРД), сім'яники з придатками в нормі і екзогенному гіпертирозі, який викликали введенням щурам з їжею L-тироксину в дозі 150 мкг/кг маси тіла протягом двох тижнів. Контроль функції щитовидної залози здійснювали шляхом визначення у крові концентрації Т3 і Т4 радіоімунологічним методом. Характеристика матеріалу подана у таблиці 2.1.1.
Таблиця 2.1.1.
Досліджуваний матеріал
№ п/пНазва тваринОрганиАутопійний і біопсійний матеріал органів людини в нормі і патологічних процесах12341Білі нелінійні щурі - 20 (норма).
Білі нелінійні щурі в нормі - 10, тироїдна патологія - 10слинні і підшлункова залози
сім'яники з придаткомпривушні слинні залози
в нормі - 3
при змішаних пухлинах - 10
підшлункова залоза - 5.2Кролі - 10 (норма).слинні і підшлункова залози.слизова оболонка ясен
в нормі - 5
при парадонтитах - 15
12343Собаки - 5 (норма).слинні і підшлункова залози4Морські свинки (мурчаки) - 10 (норма).слинні і підшлункова залози.тонка кишка в нормі - 5,
товста кишка в нормі - 5 хвоборі Гіршпрунга - 105Інші тварин - 9 (норма).слинні залози.головний мозок в нормі - 3
при менінгоенцефалітах - 7.
плацента в нормі - 13 і слабості родової діяльності - 17.Всього - 74 Всього - 98
Для одержання досліджуваного матеріалу тварини (щурі, кролі, морські свинки, собаки*) піддавалися ефірному наркозу. Вилучали слинні та підшлункову залози, тонку і товсту кишку. Слизову оболонку ясен, товсту кишку при хворобі Грішпрунга, привушні слинні залози при змішаних пухлинах, плаценту забирали у відповідних відділеннях обласної клінічної лікарні на яких розташовуються кафедри медуніверситету при участі студентів, магістрів, асистентів, доцентів відповідних кафедр, аутопсійний матеріал головного мозку забиралу у осіб, які померли в різні терміни від менінгоенцефаліту при участі асистентів і доцентів кафедри патологічної анатомії. Гістологічний матеріал відокремлювали від довколишніх тканин фіксували у рідині Буена, або у нейтральному 4% формаліні, для електронної мікроскопії матеріал фіксували глютаровим альдегідом з подальшою дофіксацією 2% OsO4 на фосфатному буфері pH-7,36. Для світлової мікроскопії гістологічний матеріал ущільнювали у парафін, для електронної мікроскопії застосовували суміш епоксидних смол епонаралдиту з подальшим контрастуванням ураніл ацетатом і 1% розчином цитрату свинцю. Для виявлення рецепторів лектинів на рівні електронної мікроскопії гістологічні проби підщелепної слинної залози, дванадцятипалої, товстої кишки, кори великих півкуль мозку вміщалися у розчин свіжого фіксатора (2% параформальдегід і 0,1% глютаральдегід у ЗФР) на 1 год. при 4?С. Вільні альдегідні групи блоковано при інкубації матеріалу в 0,1М розчині NH4Cl у ЗФР 2 год. при 4?С. Після цього проби органів промивалися у ЗФР (2?5 хв.), зневоднювалися в етанолі і заливалися у Ловікрил К4М (Sigma, USA) за методом [335].
Для світлової мікроскопії зрізи товщиною 5-7 мкм або напівтонкі зрізи товщиною 0,5-1 мкм забарвлювали гематоксилін-еозином, альдегід-фуксином за Гоморі (1960) для ідентифікації ?-інсульцитів і клітин, що продукують ІПБ, для виявлення ферментів (лужної фосфотази, метод Гоморі-Такамачі, сукцинатдегідрогинази, метод Нахласа, описані А.І.Кононським (1976)) для виявлення глікогену використовували PAS-реакцію (Пірс, 1962) сульфатовані глікозаміноглікани виявляли основним коричневим М.Г.Шубич (1961), кислі полісахариди альциановим синім (Лилли, 1969).
2.2.Характеристика використаних лектинів
мічених пероксидазою і колоїдним золотом.
Для виявлення глікокон'югатів використовували набір лектинів мічених пероксидазою і колоїдним золотом різної вуглеводної специфічності. Лектини виготовлені к.фарм.н. В.О.Антонюком у лабораторії "Лектинотест" із сировини Карпатського регіону. Концентрацію лектинів для інкубації спочатку відпрацьовували на гістологічних препаратах слинних залоз щурів. Нами встановлено, що найбільш оптимальна концентрація 50 мкг лектина на 1 мл ЗФР. Набір використаних лектинів і їх специфічність подана у таблиці 2.2.1., 2.2.2.
Таблиця 2.2.1
Лектини мічені пероксидазою та їх вуглеводна специфічність
Назва лектинуДжерело його отриманняСпецифічність лектинівPSLЛектин із насіння гороху (Pisum sativum L.)?-D-маннопіраноза і
?-D-глюкопіранозаLCAЛектин із насіння сочевиці (Lens culinaris L.)?Man>?GlcLVAЛектин із білосніжки (Leucojum vernum L.) повний аналог лектина підсніжника?Man>?GlcPMRL-
PMRL+Два лектини із купени багатоквіткової (Polygonatum multiflorum L.)NAcD Glc
DmanSTAЛектин із бульби картоплі (Solanum tuberosum L.)NAcGlcWGAЛектин зав'язків пшениці (Triticum wulgare L.)NAcDGlc>NAcNeuLABAЛектин кори золотого дощу (Laburnum anagyroides Medik)?L-FucPFAЛектин ікри окуня (Persa fluviatalis L.)?L-фукозаSBAЛектин із насіння сої (Glycine hispada (Moenh) Maxin)NAcDGalPNAЛектин із насіння арахіса (Arachis hypogaca L.)?-D-Gal-H?3 DGal
NAcD-галактозаHPAЛектин виноградного слимака (Helix pomatia)?NAcDGalLBAЛектин із насіння лімської квасолі (Phaseolus limensis L.)NAcDGalCABA-1
CABA-2Лектини кори карагани дерево видної (Caragana arborescens L.)
Лектин насіння караганиNAcDGal
NAcDGal>?GalSNAЛектин кори бузини чорної (Sambucus nigra L.)Neu 5AC/2 ? 6GalMLIЛектин омелиDGalSSAЛектин саротамнуса (Sarathamnus scoparius L.)L-арабіноза, DGalSJAЛектин софори японської (Sophora japonica L.)?DGal
NAcGalRCAЛектин кліщовини (Ricinus communis L.)?