РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Современные данные литературы свидетельствуют о возможном поступлении свинца через гематоплацентарный барьер и с молоком матери ?26, 27, 28?. Поэтому влияние хронического воздействия соединений свинца изучалось на нескольких поколениях мышей линии BALB/c, у которых строение и тип плаценты схожи с таковыми у человека [186].
Животные первого поколения получали ацетат свинца в течение всей жизни с момента прекращения грудного вскармливания, включая процессы гестации и лактации. Мыши-cамцы второго поколения были получены от животных первого поколения. Таким образом, экспериментальные животные подвергались воздействию солей свинца, начиная с прогенеза, весь антенатальный и постнатальный периоды. Исследования проводили на втором поколении мышей-самцов линии BALB/c, массой 25-30г.
Данные животные были выбраны в связи со сходством морфологического строения надпочечников и синтеза гормонов у высших млекопитающих [131, 139].
Содержание животных проводилось в сходных условиях вивария, что является необходимым условием создания структурной группы. Температура помещения, где осуществлялись эксперименты, составляла 19-22 С °[186].
С целью исключения факторов, способных оказать влияние на морфофункциональное состояние надпочечников были выбраны следующие условия проведения эксперимента:
* Все исследования были проведены в период стабильной сезонной активности коры надпочечников (июль, ноябрь-декабрь) [142].
* Учитывая циркадные суточные колебания концентрации гормонов коры надпочечников (альдостерона, кортизола, кортикостерона, андростендиона, тестостерона) и мозгового вещества (эпинефрина и норэпинефрина) меченый тритием предшественник ДНК - тимидин вводили в одно и то же время - в 12 час. дня [143, 187].
Все животные составили 4 группы:
* I-я группа - животные, ежедневно получавшие водный раствор ацетата свинца (способ введения- перорально, доза 0,01мг/г);
* II-я группа - животные с инкорпорацией соединений свинца при одновременном фармакологическом корригировании ?-токоферолом ("Фитофарм", Украина);
* III-я группа - животные, получавшие одновременно с ацетатом свинца препарат эрбисол, производимый научно-производственным центром ООО "Эрбис"[188];
* IV-я группа - контрольная группа - животные, которые перорально получали изотонический раствор хлорида натрия в адекватном объеме.
Дозы и пути введения препаратов:
* альфа-токоферол перорально в дозе 3 мг/кг массы тела, разведенный в растительном (подсолнечном) масле;
* эрбисол - 0,03 мг/кг, разведенный в изотоническом растворе натрия хлорида, вводился подкожно через день (для уменьшения степени стрессирования животных).
Забор материала произведен через 30, 60, 90 суток, что позволило подразделить данные группы на серии.
Распределение животных по сериям и группам эксперимента представлено в табл. 2.1.
Таблица 2.1
Распределение животных по группам и сериям эксперимента
Группы
животныхВид
воздействия
Серии (сутки)Всего
животных:3060 90 691-я Ацетат свинца666182-я Ацетат свинца+
альфа-токоферол666183-яАцетат свинца+эрбисол666184-яКонтроль55515
Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом путем декапитации. Надпочечные железы извлекали, освобождали от окружающей жировой клетчатки, не повреждая капсулы. Правый надпочечник использовали для светооптического исследования по стандартным методикам, окрашивая гематоксилином и эозином [189]. Левый надпочечник сразу же после извлечения рассекали лезвием на 2 части в капле 2,5 % глютаральдегида. Дофиксацию проводили в 1 % растворе OsO4. Материал обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, ацетоне и заливали в смесь эпона с аралдитом по общепринятым методикам [190, 191, 192]. Полутонкие и ультратонкие срезы изготавливались на ультрамикротоме SEO-UMC (Сумы, Украина). Ультратонкие срезы контрастировали по Рейнольдсу. Сеточки просматривали и фотографировали на электронном микроскопе ПЭМ-100 (Украина).
Для исследования активности синтеза ДНК в клетках коркового и мозгового вещества был использован метод гисторадиоавтографии с введением меченого предшественника ДНК 3Н-тимидина в дозе 6,5 мкКи/г (внутримышечно за 1 час до выведения животных из эксперимента) [190, 193].
Полутонкие срезы (1 мкм) покрывали фотоэмульсией типа "M" (разведение 1:3), проявляли через 14 дней, окрашивали толуидиновым синим. Подсчет метки проводили по срединным срезам надпочечника.
Мечеными считались ядра клеток, над которыми находилось не менее 3 зерен восстановленного серебра фотоэмульсии. Индекс меченых клеток (ИМК) вычисляли при просчете не менее 2000 клеток от одного животного в каждой зоне (клубочковой, пучковой и сетчатой) и мозговом веществе. Среди 2000 клеток подсчитывали:
1. количество меченых 3Н-тимидином темных и светлых клеток;
2. число немеченых 3Н-тимидином темных и светлых клеток;
3. количество меченых 3Н-тимидином фибробластов в корковом веществе надпочечников;
4. число немеченых 3Н-тимидином фибробластов в корковом веществе надпочечников;
5. количество меченых 3Н-тимидином клеток наружной (наружный и внутренний слои) и внутренней капсулы;
6. число немеченых 3Н-тимидином клеток наружной (наружный и внутренний слои) и внутренней капсулы;
Индекс меченых клеток определяли по результатам подсчетов как отношение числа меченых клеток в каждой из зон коры надпочечников или в мозговом веществе к общему количеству просчитанных клеток в этой зоне. Величину ИМК выражали в промиллях.
Поскольку препараты, использовавшиеся в экспериментах (гисторадиоавтографы), вследствие технологии приготовления являются фазово-амплитудными, для повышения контраста зерен восстановленного серебра при проведении фотосъемки было применено фазово-контрастное устройство типа KFZ (PZO, ПНР). Это устройство представляет собой систему переменного контраста: в каждом из четырех имеющихся в комплекте объекти