РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Хроническую свинцовую интоксикацию изучали на нескольких поколениях
мышей-самцов линии BALB/c, у которых строение и тип плаценты схожи с таковыми у
человека [109]. Изучались поджелудочные железы животных второго поколения.
Животные первого поколения получали перорально водный раствор ацетата свинца из
расчета 10 мг/кг массы тела, что по данным ряда авторов соответствует
концентрации свинца во внешней среде и оказывает влияние на организм [82,
256].
Животные первого поколения получали ацетат свинца в течение всей жизни с
момента прекращения грудного вскармливания. От животных первого поколения были
получены мыши – самцы второго поколения, которые таким образом подвергались
воздействию свинца, начиная с онтогенеза, весь антенатальный и постнатальный
период, различный по длительности после прекращения грудного вскармливания
животных.
Экспериментальные животные составили 4 группы.
В первую группу вошли животные, получавшие в течение всего экспериментального
периода дистиллированную воду в адекватном объеме (группа контроля).
Вторую группу составили животные, ежедневно получавшие перорально водный
раствор ацетата свинца в дозе 10 мг/кг (0,01 мг/г).
Третья группа – животные, получавшие ацетат свинца при одновременном
фармакологическом корригировании альфа-токоферолом в терапевтической дозе.
Четвертая группа – животные одновременно с ацетатом свинца получали препарат
эрбисол.
Дозы и пути введения препаратов:
- альфа-токоферол перорально в дозе 3 мг/кг массы тела, разведенный в
растительном масле. Дозу рассчитывали, исходя из среднесуточной
фармакологической дозы витамина Е – 20-30 мг/сутки.
- эрбисол – 0,03 мг/кг, разведенный в изотоническом растворе хлорида натрия,
для уменьшения степени стрессирования вводили подкожно через день. Эрбисол был
выбран как фармпрепарат, содержащий комплекс природных не белковых
низкомолекулярных органических соединений негормональной природы [213].
В постнатальном периоде ацетат свинца и фармпрепараты животным второго
поколения начинали вводить после лактационного периода (через 1 месяц), в
течение 30, 60, 90 суток. В результате были сформированы следующие группы и
серии экспериментальных животных (табл. 2.1).
Все животные содержались в условиях вивария, находились на свободном режиме
кормления и выпаивания [208].
С целью исключения влияния циркадных и циркосептальных ритмов на результаты
исследования, учитывая суточные колебания интенсивности обменных процессов в
тканях организма [146, 305], животных выводили из эксперимента в одно и тоже
время суток.
В соответствии с требованиями конвенции о гуманном обращении с животными из
эксперимента их выводили под эфирным наркозом путем декапитации.
За 1 час до эвтаназии животным вводили предшественник ДНК – Н3-тимидин в дозе
6,5 мкКи/г. Как известно, Н3-тимидин принимает участие в образовании
полинуклеотидной молекулы ДНК. Меченый тимидин после фосфорилирования
используется клеткой исключительно для синтеза ДНК. При поступлении в организм
Н3-тимидин, через 40 минут, включается в клетки, которые синтезируют ДНК, а
через 1 час включение его практически завершается.
Таблица 2.1
Распределение животных по сериям и группам эксперимента, шт.
Возраст животных
2 месяца
3 месяца
4 месяца
Длительность эксперимента
30 суток
60 суток
90 суток
К.
Перорально получали изотонический раствор хлорида натрия в адекватном объеме
Св.
Получали ежедневно водный раствор ацетата свинца
Св. + Vit.Е
Введение ацетата свинца при одновременном корригировании б -токоферолом
Св. + Эрбисол
Введение ацетата свинца при одновременном корригировании эрбисолом
При обработке и анализе материала использован комплексный подход. Применены
следующие методы исследования: световая микроскопия, трансмиссионная
электронная микроскопия, гисторадиоавтография, морфометрия, методы статистики.
Поджелудочную железу извлекали, освобождали от окружающей жировой клетчатки.
Сразу же после извлечения органа рассекали лезвием на две части. Часть железы
фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заключали в парафин.
Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином (по общепринятым
методикам) [184].
Другую часть железы в капле 2,5% раствора глютаральдегида рассекали на кусочки
1 мм3. Дофиксацию проводили в 1% растворе оксида осмия. Материал обезвоживали в
этаноле возрастающей концентрации и заключали в смесь эпон-аралдит по
общепринятым методикам [156, 309, 337].
Изготавливали полутонкие и ультратонкие срезы толщиной 1 мкм и 100 нм,
соответственно, на ультратоме SEO-UMC (Сумы, Украина).
Толщина 1 мкм при условии достаточно контрастной окраски позволяет оптимально
реализовать разрешающую способность световой оптики. Полутонкие срезы
окрашивали толуидиновым синим, поскольку оксид осмия блокирует вещества, дающие
реакцию с кислыми красителями [143].
Ультратонкие срезы контрастировали по Рейнольдсу. Изучение ультратонких срезов
проводили на электронном микроскопе ПЭМ-125К (Украина).
Для изучения пролиферативной активности клеток паренхимы поджелудочной железы
использовали метод гисторадиоавтографии с введением предшественника ДНК
Н3-тимидина.
Гисторадиоавтография позволяет локализовать присутствие радиоактивных изотопов
в конкретной части клетки или даже молекулы [13, 241, 259, 265]. Принцип этого
метода состоит в том, что срез ткани, включившей радиоактивные изотопы,
покрывается слоем специальной фотоэмульсии типа М. При распаде радиоактивных
атомов серебра в эмульсии они приобретают способность пр
- Київ+380960830922