РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Роботу виконано на 106 білих нелінійних статевозрілих щурах масою 150-160г
віком 4-5 місяців. Згідно поставлених завдань тварин було розподілено на такі
групи:
І – щури, яким було проведено операцію по моделюванню стандартної травми
периферійного нерва;
ІІ – тварини, яким проводили операцію по моделюванню травми периферійного нерва
та призначали після операції препарат імунодепресивної дії;
ІІІ – контрольні тварини.
В складі кожної групи виділяли кілька підгруп. В першій та другій групі тварин
розподіляли в залежності від терміну дослідження (табл.2.1). Після оперативного
втручання щурів виводили з експерименту:
І а, ІІ а – через три тижні,
І в, ІІ в – через шість тижнів,
І с, ІІ с – через 12 тижнів після операції.
Контрольна група щурів складалась з наступних підгруп:
А – інтактні тварини,
В – тварини, які підлягали несправжній операції.
Операція по моделюванню стандартної травми периферійного нерва полягала в
наступному: втручання виконували під тіопенталовим наркозом. Тіопентал вводили
інтраперитонеально в дозі 5 мг сухої речовини на 100г маси тварини (препарат
розводили у ізотонічному розчині хлориду натрію). Оперативне втручання
проводили в стерильних умовах за допомогою мікрохірургічного інструментарію.
Доступ виконувався на межі середньої та верхньої третини стегна за проекційною
лінією сідничого нерва. Після обробки операційного поля розтиналися м’які
тканини, а потім тупо за допомогою затискача виділяли сідничий нерв. Нерв
пересікався лезом безпечної бритви в вищезгаданій ділянці на межі верхньої та
середньої третини стегна. Відрізки нерва співставляли на відстані 2-3 мм, а
потім накладали шви у кількості 3-4 на нерв атравматичною голкою з
монофіламентною поліамідною ниткою 10/0 фірми Ethicon®. Після проведення
гемостазу рану ретельно зашивали. Після операційного втручання контрольні і
дослідні тварини отримували однакове харчування згідно норм віварію.
Таблиця 2.1
Група тварин
Кіль-
кість тварин
Умови експерименту
Терміни дослід-ження
Органи, що вивчались
І а
15
Моделювання травми сідничого нерва
3 тижні
Тимус, селезінка, сідничий нерв
І в
15
6 тижнів
І с
15
12 тижнів
ІІ а
15
Моделювання травми сідничого нерва з наступним введенням циклоспорину А
терміном 18 діб
3 тижні
Тимус, селезінка, сідничий нерв
ІІ в
15
6 тижнів
ІІ с
15
12 тижнів
Контроль А
Тимус, селезінка
Контроль В
12 (3х4)
Доступ до сідничого нерва з наступною його мобілізацією
0 – 3 – 6 - 12 тижнів
Тимус, селезінка
Друга група тварин підлягала аналогічній операції з призначенням препарату
імуносупресивної дії Сандімун Неорал (міжнародна непатентована назва
циклоспорин А). Препарат призначали в дозах, які визначені як
умовно-терапевтичні для даного виду тварин, терміном 18 діб. Імунодепресант
використовували, враховуючи методичні рекомендації щодо призначення ліків при
вивченні безпечності препаратів [106]. Проведений аналіз літератури відносно
застосування циклоспорину для лікування аутоімунних захворювань [69] і
результати експериментальних досліджень стосовно покращення процесів
регенерації периферійних нервів [103] визначили термін використання даного
засобу. Сандімун Неорал (препарат для перорального застосування) призначали в
дозі 5 мг/кг на добу протягом 6 діб, після чого тварин переводили на
підтримуючу дозу 2,5 мг/кг на добу, яку вводили 12 діб.
Несправжня операція полягала у виконанні аналогічного згаданому доступу до
сідничого нерва з наступною його мобілізацією (без перерізки). Після цього
м‘які тканини повертали у вихідне положення і накладали на операційну рану шов
шовковою ниткою. Ця підгрупа щурів відносилась до групи контролю і її дані
використовували як порівняння з даними експериментальних тварин.
Тварин виводили з експерименту через 3, 6, 12 тижнів за допомогою передозування
препарату Тіопентал (25 мг/100 г) при інтраперитонеальному введенні. Евтаназію
експериментальних та контрольних щурів виконували згідно міжнародних нормативів
гуманного ставлення до тварин [65, 78, 116].
Основними об‘єктами дослідження були загруднинна залоза, селезінка та сідничий
нерв контрольних тварин та щурів, яким проводили оперативне та медикаментозне
лікування.
Матеріал для морфологічного дослідження забирали відразу після евтаназії тварин
[33]. Після розкриття грудної порожнини отримували доступ до тимусу, який
виділяли з максимальною обережністю, розкриття черевної порожнини забезпечувало
доступ до селезінки, з якої виділяли шматочки розміром 1 смі. Доступ до
сідничого нерва відбувався аналогічним операції методом; ми виділяли шматочки
нерва довжиною приблизно 15 мм, в склад якого входила ділянка травми з
проксимальним та дистальним відділами.
З метою гістологічного та гістохімічного дослідження органи імунної системи
фіксували в 10% нейтральному формаліні з подальшим зневодненням в етиловому
спирті при поступовому підвищенні його концентрації з 50°С до абсолютного [89,
98]. Далі проводку здійснювали через спирт/хлороформ в рівних кількостях;
хлороформ, хлороформ/парафін у рівних частинах, занурювали в парафін за
загальноприйнятими гістологічними методиками. Виготовляли серійні парафінові
зрізи товщиною 5-7 мкм за допомогою мікротому фірми “MICROM”. Для вивчення
морфологічних особливостей органів зрізи забарвлювали гематоксиліном та
еозином, азур ІІ – еозином [4]. Для виявлення глікокон‘югатів використовували
набір лектинів, мічених пероксидазою хрону, різної вуглеводної специфічності.
Лектини виготовлені в лабораторії “Лектинотест” із сировини Карпатського
регіону. Гістохімічне визначення рецепторів до лектинів соч
- Київ+380960830922