РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Постановка досліду і об’єкт досліджень
Експериментальні дослідження проведено на 147 білих статевозрілих щурах-самцях
лінії Wistar з вихідною масою тіла 100-150 г. При виборі тварин виходили з
того, що білі щури є найбільш зручними для групового експерименту [84]. При
проведенні дослідів дотримувалися основних правил GLP (1981), Правил проведення
робіт з використанням лабораторних тварин (1977), Конвенції Ради Європи про
охорону хребетних тварин, що використовують в експериментах та інших наукових
цілях (1986), Директиви ЄЕС № 609 (1986) та наказу МОЗ України № 281 від
01.11.2000 р «Про міри по подальшому вдосконаленню організаційних норм роботи з
використанням експериментальних тварин».
Для вирішення поставлених завдань проведено три серії експериментів: І серія –
визначення морфофункціонального стану щитоподібної залози в умовах стресу на
фоні фізіологічної функції шишкоподібної залози; ІІ серія – визначення
морфофункціонального стану щитоподібної залози в умовах стресу на фоні
гіперфункції шишкоподібної залози; ІІІ серія – визначення морфофункціонального
стану щитоподібної залози в умовах стресу на фоні гіпофункції шишкоподібної
залози.
У всіх серіях досліду тварини були розподілені на три експериментальні групи:
1-ша група (контрольна) – інтактні щури, які виводилися з експерименту
одночасно з дослідними для визначення контрольних показників; 2 група –
тварини, які піддавалися стресу; 3 група – тварини, яким перед стресом уводили
мелатонін. З метою вивчення ефекту мелатоніну залежно від часу його уведення 3
група була розподілена на дві підгрупи: підгрупа І – тварини, яким перед
стресом уводили мелатонін о 14.00 год (М14); підгрупа ІІ – тварини, яким перед
стресом уводили мелатонін о 20.00 год (М20). Стрес моделювали шляхом 1-годинної
іммобілізації тварин у пластикових клітках. Мелатонін тваринам уводили в дозі 1
мг/кг за 1 годину до стресу внутрішньошлунково за методикою здобувача*
(“Вита-мелатонин”, АО “Киевский витаминный завод”, Україна).
Моделювання гіпофункції епіфіза проводили шляхом цілодобового утримування
тварин в умовах постійного освітлення (24 години) протягом 7-ми діб, постійне
освітлення здійснювали лампою денного світла 500 люкс. Гіперфункцію епіфіза
моделювали шляхом цілодобового утримування тварин в умовах постійної темряви
(24 години) впродовж 7 діб, доступ до тварин здійснювали при інфрачервоному
світлі.
Всі тварини знаходилися на стандартному раціоні в приміщенні віварію при
кімнатній температурі з вільним доступом до їжі та води. Дослідження виконували
у спеціальному приміщенні при температурі оточуючого повітря 18-20 0С та
вологості 40-45%. Тварини, яким проводили дослідження на фоні фізіологічної
функції шишкоподібної залози знаходилися при звичайному світловому режимі (12
годин світло : 12 годин темрява).
Дослідних тварин виводили з експерименту шляхом декапітації під ефірним
наркозом. Після декапітації тварин фіксували за методикою, розробленою
здобувачем**.
* Посвідчення про раціоналізаторську пропозицію № 14/03 11.03.2003. Ходоровська
А.А. та співавт. Спосіб внутрішньошлункового введеня речовин лабораторним
тваринам.
** Посвідчення про раціоналізаторську пропозицію № 12/03 11.03.2003.
Ходоровська А.А. та співавт. Спосіб фіксації лабораторних тварин при виконанні
експериментальних досліджень.
2.2. Методи досліджень та їх обґрунтування
Для гістологічного дослідження матеріал забирали у тварин всіх груп. Одразу ж
після видалення щитоподібної залози (правої частки), її зважували. Матеріал
фіксували протягом 2-3 тижнів в 10%-ному розчині нейтрального формаліну з
трьохразовою зміною фіксатора, зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації,
після чого заливали у парафінові блоки. Виготовляли гістологічні зрізи товщиною
5-6 мкм та зафарбовували гематоксилін-еозином. Гістологічні препарати
досліджували у світлооптичному мікроскопі „БІОЛАМ Р-12” і документували. Ці
методи дають можливість вивчити структуру в нормі, а також характер і глибину
морфологічних змін та послідовність розвитку адаптаційних реакцій щитоподібної
залози при стресі.
Забір матеріалу для електронно-мікроскопічного дослідження щитоподібної залози
інтактних та експериментальних тварин проводили згідно загальноприйнятих правил
[124]. Для дослідження брали шматочки щитоподібної залози, фіксували їх в 2,5%
розчині глютаральдегіду з активною реакцією середовища рН 7,3-7,4,
приготовленому на фосфатному буфері Міллонга. Фіксований матеріал через 50-60
хв. переносили у буферний розчин і промивали протягом 20-30 хв. Постфіксацію
здійснювали 1% розчином чотириокису осмію на буфері Міллонга впродовж 60
хвилин, після чого проводили їх дегідратацію в спиртах і ацетоні та заливали в
суміш епоксидних смол згідно загальноприйнятої методики.
Ультратонкі зрізи, виготовлені на ультрамікротомах УМПТ-7 та ЛКБ-ІІІ,
зафарбовували 1% водним розчином ураніл ацетату, контрастували цитратом свинцю
згідно методу Рейнольда та вивчали ультраструктурні особливості в електронному
мікроскопі ЕМВ-100 ЛМ.
Для вивчення секреторної активності щитоподібної залози та тиреотропної функції
гіпофіза визначали вміст вільних тироксину, трийодтироніну та тиреотропного
гормону в плазмі крові контрольних та дослідних тварин. Оцінку напруженості
стрес-систем оцінювали за глюкокортикоїдною функцією наднирників шляхом
дослідження вмісту кортизолу в плазмі крові дослідних тварин. Кров забирали
після декапітації, як стабілізатор використовували гепарин. Дослідження вмісту
гормонів у плазмі крові виконували за допомогою імуноферментного аналізу [22] з
використанням наборів реагентів ТТ
- Київ+380960830922