РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження та експериментальні умови.
Дослідження виконане на 200 щурах-самцях лінії Вістар. 1-у групу склали 80
молодих тварин (вік 6-7 міс. і початкова вага 110±±10 г), 2-у групу – 80 старих
тварин (вік від 18 міс. і більше і початкова вага 160±±15 г) [51]. Підготовка
тварин до експериментів й усі інвазивні втручання, знеболення і виведення з
експерименту здійснювали у відповідності до "Правил проведення робіт з
використанням експериментальних тварин" (наказ МОЗ СРСР №755 від 12.03.77 р.).
Всім тваринам під тіопенталовою (50 мг/кг) анестезією проводили тотальну
20-хвилинну ішемію, повну денервацію, делімфатизацію, оперативні втручання
проводили з дотриманням умов правил асептики і антисептики. Контролем служили
40 здорових тварин. Гостре ВН проводили 40 тваринам з 1-ї групи, 40 тваринам з
2-ї групи і 20-ти тваринам з контрольної групи. На висоті навантаження тварин
виводили з досліду. Вилучення нирок здійснювали на 10-у, 30-у і 90-у доби
дослідження. Усі тварини до і після оперативного втручання утримувались в
умовах віварію на стандартному харчовому раціоні при вільному доступі до води.
Експерименти і вилучення нирок для досліджень проводили у весняний період у
один і той же час доби між 10.00 і 13.00 у спеціальному приміщенні при
температурі оточуючого повітря 18-20°° С.
2.2. Моделювання денервації, ішемії, делімфатизації.
Вплив на нирку денервації, ішемії, делімфатизації здійснювали за розробленою на
кафедрі методикою. Перед оперативним втручанням щурів наркотизували
внутрішньочеревним введенням 1% розчину тіопенталу натрію (50 мг/кг ваги). По
досягненні ІІІ стадії наркозу тварин фіксували на операційному столику й у
стерильних умовах серединною лапаротомією розчиняли черевну порожнину,
зміщували петлі кишечнику, по черзі оголяли нирки, виділяли їхні судинні ніжки.
За допомогою бінокулярного мікроскопа МБС-10 мікрохірургічним інструментарієм
виділяли нирку з парієтальної очеревини, механічно перетинали усі видимі
нервові стовбури і волокна, що йдуть до воріт нирки і миски, звільняючи ниркову
ніжку від оточуючих тканин. Після цього вилучали адвентицію ниркової артерії та
вени, мобілізували окремо кожну кровоносну судину і серозну оболонку
юкстамедулярного відділу сечоводу протягом 3-4 мм з наступним електрофоретичним
руйнуванням нервових провідників, що залишалися у товщі стінок ниркової
артерії, вени і сечоводу [Баринов Е.Ф. та ін., 1988. Авторське свідоцтво СРСР
№1411803] (рис. 2.1). При цьому досягалася повна денервація органа, що
підтверджувалося морфологічним дослідженням, окрім цього ушкоджувалися
лімфатичні колектори, які виходять з органа, що забезпечувало блок
лімфовідтоку. Тимчасову тотальну ішемію нирок здійснювали шляхом накладання
турнікета на ниркову ніжку на 20-хвилин, після чого проводили відновлення
кровотоку.
Завершували оперативне втручання введенням у черевну порожнину розчину
пеніциліну 100 ОД/100 г ваги і пошаровим зашиванням операційної рани черевної
стінки безперервним швом за допомогою кетгутових ниток.
2.3. Методи проведення функціональної навантажувальної проби.
Гостре водне навантаження було проведене таким чином. Тваринам через шлунковий
зонд вводили підігріту (до 36 С°) водопровідну воду з розрахунку 5% від ваги
тіла [28, 101] і поміщали у спеціальні балансові клітки, що дозволяло створити
для всіх експериментальних тварин ідентичні умови. На висоті навантаження,
через 120 хвилин, тварин виводили з експерименту.
Рис. 2.1. Схема проведення електрофоретичного руйнування нервових провідників,
що залишалися у товщі стінок ниркової артерії, вени і сечоводу при здійсненні
повної денервації нирки.
2.4. Методи морфологічного дослідження нирки.
2.4.1. Макроскопічне вивчення органів.
Взяття матеріалу у тварин всіх груп проводили на 10-у, 30-у і 90-у доби
експерименту. Визначали вагу тіла тварин у кожній віковій групі. Після
вилучення органів їх зважували на торсійних вагах, оцінювали відносну вагу
органів (мг/100 г ваги тіла). Обсяг нирки визначали за кількістю витисненої
органом води. Питомі обсяги кіркової, зовнішньої мозкової та внутрішньої
мозкової речовини на фронтальних зрізах нефіксованої нирки визначали за
допомогою мікроскопа МБС-10 методом крапкової лічби з використанням принципу
Кавальєрі-Акера-Глаголєва [1].
2.4.2. Дослідження на світлооптичному рівні.
Підготовка матеріалу для світлової мікроскопії містила фіксацію нирок у
забуференому (0,1 М фосфатний буфер pН 7,4) 10%-му розчині формаліну,
зневоднення у спирті зростаючої концентрації, просвітлення у ксилолі та заливку
у парафін. З парафінових блоків готували зрізи товщиною 5±±1 мкм, які
використовували для фарбування гематоксиліном та еозином та гістохімічних
методик. Для виявлення РНК і ДНК препарати фарбували піроніном та метиленовим
синім за методом Браше [73]. При вивченні хімічного складу міжклітинної
речовини сполучної тканини оцінювали наявність і розподіл сульфатованих і
несульфатованих глікозаміногліканів (ГАГ) за допомогою відповідних методів
забарвлення: толуїдиновим синім при рН 5,3 [59] і реактиву Шифа. Контроль
селективності методу визначення сульфатованих ГАГ проводили при забарвленні
толуїдиновим синім при рН 2,6, несульфатованих ГАГ – після обробки амілазою.
Зрілі колагенові волокна ідентифікували пікрофуксином за методом ван Гізона.
Оцінку структурних елементів нирки проводили за 7-ма зонами (рис. 2.2): 1 зона
– зовнішня смужка кіркової речовини; 2 зона – внутрішня смужка кіркової
речовини; 3 зона – зовнішня смужка зовнішньої мозкової речовини; 4 зона –
внутрішня
- Київ+380960830922