РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальное исследование проведено на 216 беспородных белых крысах самцах. Всё исследование выполнено на 1296 препаратах. В работе использованы животные двух возрастных групп: неполовозрелые и репродуктивного периода (1 и 5 месяцев от рождения, с исходной массой 50 - 55 г и 180 - 200 г) [72] (табл. 2.1).
Таблица 2.1
Распределение экспериментальных животных по возрасту, сериям и срокам эксперимента
Возраст животныхСерияКоличество животных7 суток15 суток30 суток60 сутокНеполовозрелыйК6666Ф 16666Ф 26666Б6666С6666Репродуктивный периодК6666Ф 16666Ф 26666С666654545454Всего216
Животные обеих возрастных групп были разделены на серии в зависимости от использованного препарата. В сериях Ф 1 и Ф 2 представлены животные, получавшие фенобарбитон в дозах 30 и 70 мг/кг массы тела соответственно. Среди неполовозрелых крыс выделена серия животных Б, которым вводили 35 мг/кг бензонала. Контролем (К) для этих серий служили животные, получавшие дистиллированную воду из расчета 10 мл/кг. Серию С составили животные, которые на фоне введения 30 мг/кг фенобарбитона получали силибор в дозе 80 мг/кг. С целью коррекции предполагаемых морфологических изменений нейронов и клеток глии, связанных с воздействием барбитуратов на нервную ткань, нами использовался отечественный препарат силибор, обладающий гепатопротекторным действием [149]. Обоснованность применения данного препарата связана с его способностью изменять метаболизм веществ при хронических интоксикациях [234]. Кроме того, силибор имеет способность снижать содержимое щелочной фосфатазы [129], повышение уровня которой наблюдается как раз при применении фенобарбитала, повышает приток Са2+ в клетку [21], что снижает токсический эффект барбитуратов, при применении которых происходит его снижение [260, 273]. Силибор также является стабилизатором биомембран клеток [179], повреждение которых происходит при приеме барбитуратов [255]. Все препараты вводились ежедневно и в одно время в виде суспензии на дистиллированной воде при помощи желудочного зонда.
В эксперименте использованы препараты следующих фирм-производителей: "Elegant India" - фенобарбитон, казанского производственного химико-фармацевтического объединения "Татхимфармпрепараты" - бензонал и харьковской фармацевтической фирмы "Здоровье" - силибор. Все медикаменты приобретены на Луганском областном коммунально-производственном предприятии "Фармация".
Постановка эксперимента осуществлялась в соответствии с требованиями, изложенными в Приложении 4 к "Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных", утвержденных приказом № 755 от 12. 08. 77 г. МЗ СССР "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных". Все животные содержались в стандартных условиях вивария. В ходе эксперимента проводились наблюдения за динамикой массы тела подопытных животных с взвешиванием их каждые 10 дней. При ежедневном наблюдении за общим состоянием и поведением животных каких-либо отклонений от нормы не выявлено.
По истечении сроков эксперимента (7, 15, 30 и 60 дней) животных декапитировали под эфирным наркозом с соблюдением основных требований к эвтаназии [155]. Экспериментальный материал (спинной мозг) фиксировали в 10% нейтральном формалине на физиологическом растворе. Так как серое вещество спинного мозга (в том числе и двигательные ядра передних рогов) сильнее всего развито в шейном и грудном отделах [120, 224], то для заливки в парафин брали кусочки спинного мозга, соответствующие верхнему грудному отделу. Полученные на санном микротоме парафиновые поперечные срезы спинного мозга толщиной 5 - 10 мкм окрашивались гематоксилин-эозином, крезиловым фиолетовым по Нисслю в модификации И.В. Викторова [26], импрегнацией серебром по методу Бильшовского.
В соответствии с поставленной целью исследования вначале изучена топография двигательных ядер и их морфологические особенности в норме (контроль), а затем после проведения эксперимента. При этом во внимание принимались данные, изложенные в работах [246, 259] (рис. 2.1). Так, на рисунке 2.1 линиями обозначены границы пластинок, в области которых, по данным указанных авторов, расположены двигательные ядра передних рогов (обозначены кружочками). Их четыре: передне-латеральное и передне-медиальное (IX пластинка), центральное (VIII пластинка) и яро основания переднего рога (VII пластинка).
Окрашенные поперечные срезы спинного мозга исследовались в светооптическом микроскопе и фотодокументировались с помощью цифрового фотоаппарата. Данные методы исследования позволили изучить структуру двигательных центров передних рогов спинного мозга крыс в норме, а также характер, глубину и последовательность развития
VII
VIII
IX
IX
Рис. 2.1 Схема топографии ядер передних рогов спинного мозга белой крысы (по B. Rexed, 1952, с изменениями).
Условные обозначения:
VII, VIII, IX - пластинки серого вещества переднего рога спинного мозга крысы.
Л - передне-латеральное ядро;
М - передне-медиальное ядро;
Ц - центральное ядро;
О - ядро основания переднего рога.
морфологических изменений, изучаемых ядер в эксперименте.
Для электронномикроскопического исследования нейронов ядра основания передних рогов спинного мозга под бинокулярной лупой МБС - 2 в сером веществе каждого сегмента иссекалось по 5 кусочков (около 1 мм3 каждый) из отдела соответствующего исследуемому ядру, которые фиксировались в 2,5% растворе глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,2, потом в осмиевом фиксаторе по Паладе. После дегидратации в растворах этанола с возрастающей концентрацией и абсолютном ацетоне материал заливали смесью эпоксидных смол эпон-аралдит. На ультрат