РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Методика экспериментальных исследований
Для того, чтобы подтвердить или опровергнуть предположение о том, что энкефалины могут оптимизировать репаративный остеогенез мы выполнили экспериментальные исследования на животных. Предпосылкой к поиску эндогенных веществ, способных влиять на репарацию кости, послужило предположение о том, что в механизме формирования дистрофических кист костей одно из мест занимает локальное нарушение регенераторной способности костной ткани.
Выбор пал на даларгин, синтетический аналог эндогенных опиоидных пептидов, так как согласно имеющимся сведениям, этот препарат в наибольшей степени отвечает требованиям, предъявляемым к стимуляторам подобного рода и не дает побочных эффектов.
В задачи эксперимента не входило моделирование костной кисты и последующее воздействие на нее. Обусловлено это тем, что создать модель, патогенетически близкую к патологическому процессу, практически невозможно. В то же время, существующие способы моделирования кистовидной перестройки, путем введения в кость форменных элементов крови, или в сочетании с параллельным введением паратгормона, рентгеновским облучением, соляной кислоты [24, 36, 349], криовоздействия на дефект костной ткани [84], использования ультразвука высокой мощности [322, 331, 426] несовершенны и в полной мере не отражают изменения, происходящие в костной ткани при развитии кист у детей. Поэтому изучали процессы репаративной регенерации дефекта костной ткани заполненного кровяным сгустком для выявления оптимизирующего действия энкефалинов на репаративный остеогенез.
Моделирование дефекта проксимального метафиза большеберцовой кости было воспроизведено на 56 2-х месячных (неполовозрелых) белых лабораторных крысах линии Вистар. Животные были средней живой массы 171, 66 + 4,41 г.
Дефект проксимального метафиза большеберцовой кости животным наносили оперативным путем, в условиях асептики под ингаляционным наркозом. Шерсть на поверхности правой голени выстригали, операционное поле обрабатывали 2% йодной настойкой. После рассечения кожного покрова в области проведения предполагаемого травматического повреждения рассекали фасции, разводили мышцы и обнажали проксимальный метафиз большеберцовой кости.
Моделирование дефекта выполняли сферическим стоматологическим бором диаметром 2 мм при помощи портативной бормашины типа БЭПБ-06. Формировали дефект метафиза большеберцовой кости ниже зоны роста, просверливая транскортикальное отверстие до мозгового канала. Дефекты стандартного размера (с определенным диаметром и глубиной) дают возможность с достоверной точностью проводить морфометрические исследования области повреждения по срокам наблюдения.
После выполнения дефекта и формирования в области раны кровяного сгустка, рана была послойно ушита.
В последующем крысы содержались на стандартном рационе питания в обычных клетках, что не ограничивало их подвижность.
Состояние животных (подвижность, нагружение конечности, состояние оперированной конечности) фиксировали ежедневно.
Экспериментальные исследования на животных проводились в соответствии с Международными требованиями о гуманном обращении с животными, соблюдая правила "Европейской конвенции защиты позвоночных животных, использующихся в экспериментальных и других научных целях" [ 359].
В соответствии с целью и задачами исследования было проведено 3 серии экспериментов:
1 серия - животные, которым воспроизводили дефект в проксимальном метафиза большеберцовой кости;
2 серия - животные, которым выполняли дефект в проксимальном метафизе большеберцовой кости с последующим внутримышечным введением даларгина;
3 серия - животные, которым выполняли дефект в проксимальном метафизе большеберцовой кости с последующим внутрибрюшинным введением даларгина.
Распределение животных по сериям эксперимента представлено в таблице 2.1.
Таблица 2.1
Распределение животных по сериям эксперимента
Серия Характер экспериментаСроки выведения животных из эксперимента (сут.)Кол-во животных 1Моделирование дефектов в проксимальных метафизах большеберцовых костей1373143213283
Продолжение табл. 2.1
Моделирование дефектов в проксимальных метафизах большеберцовых костей + внутримышечное введение даларгина13731432132833Моделирование дефектов в проксимальных метафизах большеберцовых костей + внутрибрюшинное введение даларгина1373143213283
Примечание: В первые часы после операции погибло 8 животных (№ 2, 7, 16, 26, 31, 34, 46, 55). От нагноения ран пало 3 животных (№ 14, 36, 44).
Первая серия опытов контрольная, в которой лекарственное вещество не вводили. Изучалась репаративная регенерация образованного дефекта кости, заполненного кровяным сгустком.
Во 2 и 3 сериях опытов животные со вторых суток в течение 10 дней ежедневно получали даларгин из расчета 20мкг/кг массы. Целью исследований являлось выявление наиболее оптимального пути введения препарата для оптимизации процесса репаративной регенерации дефекта костной ткани заполненного кровяным сгустком. Во 2 серии даларгин вводили внутримышечно в противоположную голень, в 3 серии - внутрибрюшинно (в париетальную брюшину передней брюшной стенки) приравнивая эффект воздействия к внутривенному и внутрикостному. [14, 119, 136].
Во всех сериях рентгенологическое исследование формирующегося регенерата оперированного сегмента кости выполнялось под наркозом на 7, 14, 21, 28 сутки рентгеновским диагностическим аппаратом РУМ-20.
Животные были выведены из экспериментов путем передозировки эфира на 1, 7, 14, 28 сутки после воспроизведения оперативного вмешательства.
Макроскопический анализ материала проводили после препарирования оперированной конечности. Оценивали состояние большеберцовой кости и области травматического повреждения.
Для микроскопического анализа большеберцовые кости опериров