РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Радіаційна модель та методичне забезпечення досліджень
Експериментальні дослідження проводили на щурах-самцях лінії Вістар масою
150-180 г. Тварин утримували на стандартному раціоні при вільному доступі до
води. Разове тотальне опромінення тварин у дозах 0,2; 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 7,0
та 9,0 Гр за потужності дози 0,1 Гр/хв і в дозах 1,0; 5,0 та 9,0 Гр за
потужностей доз 0,001; 0,01; 0,1 та 1,0 Гр/хв проводили від джерела 60Со на
г-випромінювачі „ГУ – 70000” Інституту фізичної хімії НАН України за участі
спеціальної дозиметричної служби. В кожній експериментальній і контрольній
групі використовували по 10 тварин. Адекватним контролем слугували удавано
опромінені тварини відповідної вікової групи, яких утримували в аналогічних
умовах. Експеримент проводили у квітні-липні, отже, були враховані сезонні
зміни радіочутливості. У тварин контрольної групи показники визначали в той же
день, що й у опромінених тварин, яких обстежували через 0,5; 1, 2, 4, 6, 8, 10,
15, 20, 30, 45, 60, 90, 120 діб (при дослідженні залежності показників від
дози) і через 0,5; 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20 та 30 діб (при дослідженні
залежності показників від потужності дози) після впливу іонізуючої радіації (і
тільки тварин, опромінених в дозах 7,0 і 9,0 Гр, обстежували протягом 20 і 15
діб, відповідно).
Спектрофотометричне визначення дієнових кон’югатів і малонового діальдегіда.
Спектрофотометричне визначення дієнових кон’югатів (ДК) є одним із
найдоступніших методів, які використовуються в лабораторній діагностиці для
оцінки перекисного окиснення ліпідів в плазмі крові [13]. Принцип методу
полягає у вимірюванні інтенсивності поглинання у діапазоні 232-234 нм,
зумовленому кон’югованими дієновими структурами, які виникають при утворенні
гідроперекисів поліненасичених жирних кислот. Попередньо проводять екстракцію
ДК із плазми крові за допомогою гептан-ізопропанолової суміші [55].
Хід визначення: в пробірку до 5 мл крові додавали 0,1 мл 5% розчину ЕДТА.
Екстракцію проводили, додаючи до 0,2 мл плазми 8 мл гептан-ізопропанолової
суміші (1:1). Для розділу фаз до проби доливали 1 мл розчину HCl з рН 2,0.
Ізопропанолову фазу додатково очищували за допомогою 1,5 г NaCl.
При обстеженні контрольної групи тварин використовували спрощену модифікацію
способу: до 0,2мл плазми крові додавали 6 мл гептан-ізопропанолової суміші
(2:1), приготованої перед дослідом. Пробу струшували 15 хв на апараті АВУ-4П в
пробірках місткістю 50 мл, додавали 1 мл розчину НCl з рН 2,0, швидко
струшували і після відстоювання відбирали верхню гептанову фазу.
Оптичну густину гептанових і ізопропанолових екстрактів вимірювали на
спектрофотометрі СФ-26 при л=232 нм. За контроль брали гептанові та
ізопропанолові екстракти, отримані після заміни плазми 0,2 мл дистильованої
води. Вміст дієнових кон’югатів розраховували за співвідношенням Е232 /Е220 в
гептановій та ізопропаноловій фазах.
Вміст малонового діальдегіду (МДА) у сироватці крові визначали
спектрофотометричним методом (на спектрофотометрі СФ-26) за вмістом продуктів,
які взаємодіяли з 2-тіобарбітуровою кислотою [301].
Хід визначення: до 0,3 мл свіжої сироватки або плазми крові без гемолізу
додавали 3 мл 1 % ортофосфорної кислоти (перевіряючи рН розчину); 1 мл 0,6 %
ТБК (яка зберігається в темній посудині і розчинюється при невеликому
нагріванні) і 0,1 мл розчину сірчанокислого заліза (28 мг FeSO4 7H2O в 10 мл
дистильованої води), що відповідає 1 мкмоль в пробі. Пробірки ставили на 1 год
в киплячу водяну баню, потім охолоджували в холодній воді, додавали 4 мл
бутанолу, старанно змішували і центрифугували 10 хвилин при 3000 об/хв.
Вимірювали оптичну густину верхньої фази за довжини хвилі 535 нм (Еоп) проти
бутанолу. Розрахунок вмісту продуктів, що реагують з ТБК, проводили, враховуючи
коефіцієнт молярної екстинції МДА, яка дорівнює 0,156 Ммоль/см:
А = Еоп •106 •4 мл /0,156 •106 •0,3 мл = Еоп •85,47
де А – вміст МДА (в мкмоль/л або нмоль/мл), 4 мл – об’єм бутанольної фази, 0,3
мл – об’єм сироватки.
Одночасне флюорометричне визначення концентрації вітамінів Е і А в сироватці
крові.
Концентрацію вітамінів Е і А в сироватці крові визначали флюорометричним
методом. Спектрофлюорометрію б-токоферола проводили за довжини хвилі збудження
295 нм і флюоресценції 320 нм, а ретинола – відповідно за 335 та 460 нм. Ширина
щілини при використанні спектрофлюорометра MPF-2A дорівнювала 8 нм для б
-токоферолу і 16 нм для ретинолу [330].
Хід визначення: до 0,2 мл сироватки крові додавали 0,2 мл бідистильованої води
і проби струшували протягом 30 с. Після цього додавали 1 мл етилового спирту і
проби знову струшували 30 с. Додавши 5 мл н-гексану, зразки енергійно
струшували протягом 40 хв. Тривалість струшування зразків з гексаном відіграє
вирішальну роль під час дослідження і вимагає особливої стандартизації. Після
струшування проби центрифугували 10 хв при 1500 об/хв. Для
електрофлюорометрографії брали гексановий шар, що чітко відділився (3 мл); він
може зберігатися в темноті в щільно закоркованій пробірці протягом 2 год.
Паралельно із зразками сироватки готували стандартні і контрольні проби. В
стандартні проби замість сироватки брали 0,2 мл робочого стандартного розчину
б-токоферолацетату (20 мкмоль/л) або ретинолацетату (2,5 мкмоль/л) в етанолі.
Спектрофлюорометрію б-токоферолу проводили при довжині хвилі збудження 295 нм і
флюоресценції 320 нм, а ретинолу – відповідно при 335 та 460 нм. Ширина щілини
при використанні спектрофлюорометра MPF-2A дорівнювала 8 нм для б -токоферолу і
16 нм для ретинолу. Концентрацію вітамінів в сироватці кров
- Київ+380960830922