РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Групування дослідів
Для вирішення поставлених задач були проведені експериментальні дослідження на 584 зразках периферійної крові здорових донорів віком 21-40 років.
Кров отримували натщесерце вранку за допомогою одноразових пластикових шприців із кубітальної вени в пробірки для центрифугування з розчином гепарину (25 ОД/мл). Суспензію лімфоцитів отримували за стандартним методом [205] центрифугуванням у градієнті густини фікол-триомбраст (?=1,077 г/см3) із наступним відмиванням у фосфатно-сольовому буфері, рН 7,4. Кількість клітин у суспензії становила в середньому 1-1,5?106/мл [206].
У роботі використано пептидний комплекс, отриманий із кіркової речовини нирок свиней та великої рогатої худоби за оригінальним методом [175]. Згідно методу, обробку тканин кіркової речовини нирок проводили органічним розчинником для знежирення, пермеабілізації мембран та денатурації високомолекулярних білків. Екстракцію проводили трифтороцтовою кислотою в присутності СаCl2, ZnCl2 та MgCl2 та преципітували органічним розчинником для незворотньої денатурації частини білків, виділення з екстракту преципітованих пептидів. У результаті висушування, перерозчинення та ультрафільтрації на кінцевому етапі одержували пептидні молекули з молекулярною вагою менше 10 кДа [175].
Отриманий екстракт давав позитивну біуретову реакцію, мав спектр поглинання в УФ-області з максимумом 210-220 нм, характерний для пептидного зв'язку. Порівняння даних високоефективної рідинної хроматографії екстракту з екстрактами, отриманими за методом K. Falk et al. (1991), визначило подібність цих пептидних сумішей для HLA-DR5 та DR1 [176].
Гель-хроматографією визначено дві основні фракції з молекулярною масою 4 та 8 кДа. При проведенні електрофорезу в поліакріламідному гелі визначено чотири основних фракції.
При дослідженні амінокислотного складу ПКН знайдено високу відносну кількість глутамінової, аспарагінової кислот, аргініну та лізіну. Ідентифіковано окремі найбільш багаточисленні фракції пептидної суміші: іпсилон-ланцюг гемоглобіну (55-66, 56-66), альфа-ланцюг гемоглобіну (48-61), убіквітін (1-20) [126]. Характерною ознакою пептидів, зв'язаних з молекулами ГКГС, є наявність в пептидному екстракті пептидів, що є фрагментами білків, які звичайно не експресуються (іпсілон-ланцюг гемоглобіну продукується на початку ембріонального періоду) [207-209]. Отриманий за даним методом пептидний екстракт наданий переважно пептидами головного комплексу гістосумісності [4].
Як препарат порівняння було використано комплекс пептидів тимусу - тималін, виробництва заводу медичних препаратів (Санкт-Петербург, Росія).
Суспензію лімфоцитів інкубували у середовищі 199 (Sigma, USA) з 10% інактивованою телячою сироваткою (Bio Mark Inc, Україна) при 37?С. При тривалих інкубаціях використовували середовище RPMI-1640 (Gibco BRL, Scotland) із додаванням 10% інактивованої телячої сироватки (Bio Mark Inc, Україна), 10 мМ HEPES (Sigma, USA) та 100 мкг/мл гентаміцину сульфату (ДНЦЛЗ, Україна).
Інкубацію інтактних клітин з ПКН та тималіном у кінцевих концентраціях 0,05; 0,12 та 0,5 мкг/мл проводили протягом 30, 60 хвилин та 24 годин при 37?С, в подальших серіях використовували максимально ефективну концентрацію (табл. 2.1.1). В якості контролю використовували фосфатно-сольовий буфер (ФСБ).
Дані терміни інкубації є загальноприйнятими та використовувались при дослідженні впливу тактивіну та мієлопіду на експресію поверхневих імуноглобулінових рецепторів В-клітин (інкубація 30 хвилин) [28], впливу тимодепресину на експресію маркерів активації лімфоцитів [210] і на кровоутворюючі клітини-попередникі (інкубація 60 хвилин) [211], при дослідженні фізіологічних ефектів ПКН (інкубація 60 хвилин) [212]. Модель 24-х годинної інкубації з ПКН та тималіном використовувалась для визначення процесів апоптозу тимоцитів та лімфоцитів [86, 87].
Таблиця 2.1.1.
Серії експериментальних досліджень з інтактними клітинами
№ серіїЕкспериментальна модельКінцева концентрація речовин на 1 мл суспензії клітин1231Дослідження впливу ПКН та тималіну на інтактні лімфоцити при інкубації протягом 30 хвилин
Інтактні клітини (n=5)
Клітини, інкубовані з ПКН протягом 30 хвилин (n=5)
Клітини, інкубовані з тималіном протягом 30 хвилин (n=5)
0,05 мкг/мл ПКН
0,12 мкг/мл ПКН
0,5 мкг/мл ПКН
0,05 мкг/мл тималіну
0,12 мкг/мл тималіну
0,5 мкг/мл тималіну2Дослідження впливу ПКН та тималіну на інтактні лімфоцити при інкубації протягом 60 хвилин Інтактні клітини (n=6)
Клітини, інкубовані з ПКН протягом 60 хвилин (n=6)
Клітини, інкубовані з тималіном протягом 60 хвилин (n=6)
0,05 мкг/мл ПКН
0,12 мкг/мл ПКН
0,5 мкг/мл ПКН
0,05 мкг/мл тималіну
0,12 мкг/мл тималіну
0,5 мкг/мл тималіну3Дослідження впливу ПКН та тималіну на інтактні лімфоцити при інкубації протягом 24 годин
Інтактні клітини (n=6)
Клітини, інкубовані з ПКН протягом 24 годин (n=6)
Клітини, інкубовані з тималіном протягом 24 годин (n=6)
0,05 мкг/мл ПКН
0,12 мкг/мл ПКН
0,5 мкг/мл ПКН
0,05 мкг/мл тималіну
0,12 мкг/мл тималіну
0,5 мкг/мл тималіну
Методичний підхід при дослідженні молекулярних механізмів дії пептидних комплексів нирок та тимусу базувався на використанні індукторів та інгібіторів внутрішньоклітинних регуляторних систем, що беруть участь в реалізації ефектів біологічно активних речовин, шлях сигнальної трансдукції яких достатньо вивчений [213]. Інкубацію клітин з ПКН та тималіном проводили безпосередньо з інтактними лімфоцитами або після попередньої інкубації з фізіологічно-активними речовинами.
В якості ендогенних імуномодуляторів було використано інтерлейкін-2, гідрокортизон та ?-інтерферон (табл. 2.1.2). Інтерлейкін-2 (ІЛ-2) забезпечує індукцію сигналів каскаду міжклітинних взаємодій, созрівання, диференціювання та функціонування імунокомпетентних клітин. Суспензію лімфоцитів інкубували з додаванням 10% супернатанту двохдобової культ