Розділ 2
МЕТОДОЛОГІЧНА ЧАСТИНА
2.1. Методологія “експресійної генетики” у виявленні молекулярних маркерів
пухлин
Як зазначалося на початку підрозділу 1.2, найбільш ймовірно, що більшість
пухлин виникає внаслідок сукупних кооперативних ефектів домінантних і
рецесивних пошкоджень декількох онкогенів і пухлиносупресорних генів, що
порушують контрольні механізми росту та диференцировки клітини і індукують
процес її пухлинної трансформації [Bishop, 1991; Hunter, 1991].
Пошук нових онкогенів і пухлиносупресорних генів залишається метою інтенсивних
досліджень. Класично, дослідники генетики раку концентрували зусилля на
вивченні змін, що відбуваються в геномній ДНК. Останніми роками експресійна
генетика, – термін запропонований Рут Сейгер [Sager, 1997; Zhang et al., 1998]
– заснована на скринінгу диференційної експресії генів в пухлинних клітинах
щодо їх нормальних аналогів, зрушила фокус від ДНК до РНК в процесі виявлення
нових онкогенів, антионкогенів, а також інших пухлиноспецифічних маркерів,
необхідних для кращого розуміння молекулярних механізмів ініціації і прогресії
пухлинного процесу.
Онкогени залучені до дерегуляції широкого спектру клітинних процесів:
проліферації клітин [Marshall et al., 1998], репарації ДНК [Sancar, 1996],
стабільності хромосом [Tuteja et al., 2001], міжклітинних взаємодій [Jamieson
et al., 1998], взаємодії клітини з матриксом [Hirano et al., 1992; Albelda,
1993], ангіогенезу [Bergers et al., 2003], старіння [Swisshelm et al., 1995],
апоптозу [Labazi et al., 2003] та інших. Досі, незважаючи на значні зусилля по
пошуку класичними методами мутованих в пухлинах генів, вдалося ідентифікувати
лише невелику кількість онкогенів, що беруть участь в цих процесах; більшість з
них задіяна в регуляції клітинного циклу [Sager, 1994; Delgado et al., 2006],
дуже мало відомо про гени, які функціонують на стадії інвазії або
метастазування. Кількість генів, залучених до пухлинного процесу в певному типі
клітин, оцінюється приблизно в 1% від загального числа генів, що експресуються
в цих клітинах, тобто 150-300 генів [Bauer et al., 1993; Sager, 1997]. Тому,
виділені класичними методами трохи більше сотні онкогенів і близько 12
супресорних генів, делеції або мутації яких асоційовані з туморогенезом в
одному або кількох типах раку, є лише невеликою часткою генів, що беруть участь
у виникненні і прогресії різних типів пухлин людини.
Парадоксально, що деякі гени мутовані в пухлинних клітинах, тоді як інші зі
схожою функцією не мають мутацій. Прикладами є: супрессорний ген ретінобластоми
RB1, який часто мутований в певних типах раку, і p107, який не мутований, а
також мутований ген INK4 білка p16 і немутований ген білка p15 [Serrano et al.,
1996; Sherr, 1996]. Онкогенною може бути як знижена експресія р107, так і
надекспресія гена рецептора епідермального фактора росту EGFR і гена рецептора
естрогену, що приводять до зміни шляхів трансдукції сигналу і експресії
модульованих ними генів [Castro et al., 1993]. Надекспресія гена в пухлині може
бути наслідком його ампліфікації, тобто зміни на геномному рівні, а може
відбуватися і без ампліфікації. Прикладом є ген цикліну D1 [Sherr, 1996].
Очевидно, змінює свою експресію в пухлинних клітинах набагато більше генів, ніж
має мутації. Немутовані гени з постійно зміненою експресією в різних типах
пухлин є одним з ключових компонентів проблеми генетики раку, як з погляду
розуміння молекулярних основ пухлинного процесу, так і зважаючи на їх
потенційну роль в розробці агентів протипухлинної хіміотерапії. Індивідуальні
гени можуть мати змінену експресію або внаслідок мутації на рівні ДНК, або
через зміни в їх регуляції. На підставі цього Сейгер було запропоновано
групування пухлиноспецифічних генів на два класи: гени I класу – ті, що мутують
або делетовані в пухлинах, і гени II класу – незмінені на рівні ДНК [Sager,
1997]. Швидше за все, гени II класу впливають на фенотип змінами в експресії
[Sager, 1989]. Таким чином, ретровірусні онкогени представляють собою онкогени
I класу, що мутують, а EGFR – представник онкогенів II класу. Супресор
ретинобластоми RB1 [Gallie et al., 1991] є пухлиносупресорним геном I класу, а
супресор раку молочної залози маспін [Zou et al., 1994] – пухлиносупресорним
геном II класу. Деякі гени можуть в певних ситуаціях відноситися до I класу, а
в інших – до II класу. Прикладом є супресорний ген MTS1 (p16) – ген, що бере
участь в інгібуванні клітинного циклу, для якого в деяких випадках метилювання
промоторної ділянки приводить до мовчання без мутації [Shapiro et al., 1995], в
той час, як в інших випадках його інактівация відбувається за рахунок делеції
[Walker et al., 1995]. Інший приклад – супресорний ген BRCA1. Він виявлений як
мутований ген у сімейному раку молочної залози [Futreal et al., 1994], проте в
більшості первинних пухлин знайдена його знижена експресія без зміни на рівні
ДНК [Thompson et al., 1995].
Зрештою, пухлиноспецифічні гени обох класів можуть виявлятися дієво по їх
зміненій експресії, що приводить до ненормального фенотипу в пухлинах. Тому,
виявлення генів, що диференційно експресуються в пухлинних клітинах в
порівнянні з нормальними, є одним з альтернативних підходів (а для генів класу
ІІ, напевне, єдиним) до виявлення онкогенів, супресорних генів і інших
пухлиноспецифічних маркерів. Результатом чисельних досліджень з використанням
експресійної генетики є значний ріст кількості виявлених супресорних генів
різних типів раку. Наприклад в базі даних пухлиносупресорних генів на
веб-сторінці http://www.cise.ufl.edu/~yy1/ HTML-TSGDB/Homepage.html налічується
174 дійсних і потенційних пухлиносупресорних ген
- Київ+380960830922