2
Оглавление
Введение. 5
Глава 1. Литературный обзор. «Контактная микроскопия.», «Зонные пластинки Френеля жесткого рентгеновского диапазона.» 8
1.1 Введение. 8
1.2. Контакгная микроскопия. 11
1.2.1 .Техника контактной микроскопии. 11
1.2.2 Достижения контактной микроскопии. 16
1.3 Зонные пластинки Френеля. 27
Глава 2. Зонная пластинка Френеля жесткого
рентгеновского диапазона. 37
2.1 Теория дифракционной эффективности слоистой пропускающей оптики 37
2.1.1. Пропускающая дифракционная решетка на основе многослойной структуры. 37
2.1.2.Приближение трех взаимодействующих порядков. 42
2.1.3 Численный метод. 43
2.2 Зонная пластинка Френеля в жестком рентгеновском диапазоне. 44
2.3 Выбор оптимальных материалов для изготовления
зонной пластинки. 51
2.3.1 Металлы и диэлектрики. 51
2.3.2. Комбинированные сложные оксиды (стекла). 54
2.3.3 Применение численного моделирования для сравнения эффективности дифракции в разные порядки в некоторых практических примерах. 59
Выводы 62
Глава 3. Экспериментальная установка для работы с зонными пластинками и контактной микроскопии. Экспериментальное исследование оптических свойств зонных пластинок. 63
з
3.1. Малоугловой дифрактометр АМУР-1. 63
3.2 Формирование пучка 64
3.3 Модернизация дифрактометра АМУР-1. 70
3.3.1 Основные требования к механической основе микроскопа. 70
3.3.2. Держатель образца. 71
3.3.3. Держатель приемника. 73
3.3.4. Возможные схемы эксперимента. 76
3.3.4.1. Пропускающий рентгеновский микроскоп 76
3.3.4.2 Сканирующий рентгеновский микроскоп. 77
3.3.4.3 Контактная микроскопия. 77
3.4 Схемы экспериментов, проведенных на модифицированном дифрактометре. 81
3.4.1 Эксперименты с зонными пластинками. 81
г
3.4.2. Контактная микроскопия. 81
3.5 Проектирование, изготовление и испытание зонной пластинки Френеля. 88
3.5.1 Проектирование зонной пластинки. 88
3.5.2 Производство зонных пластинок. 89
3.5.3 Испытание зонной пластинки. 93
3.5.3.1 Выбор параметров пучка. 94
3.5.3.2 Настройка зонной пластинки. Измерение контраста центрального задерживающего экрана относительно многослойного покрытия и коэффициента пропускания. 96
3.5.3.3 Определение эффект фокусировки ецшггалляционным детектором. 96
3.5.3.4 Регистрация эффекта фокусировки на фотопленку. 100
3.6 Зонная пластинка из материалов Си-А1. 105
3.7 Другие применения экспериментальной установки. 111
Выводы * 111
4
Глава 4. Контактная микроскопия биологических и полимерных объектов (трековых мембран). Микроскопия Шварцшильда трековых мембран. 113
4.1 Контактная микроскопия биооріанических объектов
и полимерных пленок. 113
4.1.1 Цели исследований. 113
4.1.2 Подіт>товка биологических объектов для рентгеновских исследований. 115
4.1.3 Полученные результаты. 117
4.1.4 Контактная микроскопия трековых мембран. 130
4.2 Микроскопия Шварцшильда трековых мембран. 135
4.2.1 Объектив Шварцшильда. 139
4.2.2 Изображение системы трековых мембран. 142
4.2.3 Численный расчет поля за трековой мембраной. 148
Выводы. 148
Выводы диссертации. 150
Библиография 153
5
Введение.
Рентгеновская микроскопия как метод наблюдения скрытых деталей непрозрачных в видимом диапазоне объектов с варьируемой глубиной проникновения и микронным и субмнкронным разрешением все больше привлекает внимание исследователей. Актуальность метода продиктована поиском инструмента, способного обеспечить наблюдение за такими процессами как развитие эмбриональных зародышей, трансформация и рост их внутренних органов, рост и развитие опухолей, определение природы и причин происходящих доброкачественных и злокачественных изменений. Достоверность результатов многократно возрастет, если иметь практическую возможность наблюдать все эти процессы па одном живом биологическом образце, так как при этом вычитаются все факторы индивидуальной изменчивости. До появления рентгеновской микроскопии это было практически невозможно, поскольку единственным способом реконструкции внутренностей непрозрачного объекга в биологии остается тотальная гистология, сопряженная с разрушением исследуемого образца.
Прогресс в рентгеновской микроскопии связан с развитием технологии производства рентгенооптических элементов (многослойные зеркала, зонные пластинки, Брэгг-Френелевская оптика) и регистрирующей аппаратуры (ССЭ-детскторы, фотопленки, резисты), что позволяет получать изображения биологических объектов достаточного качества и разрешения для решения прикладных биологических и физических задач. Наибольший успех достигнут в диапазоне длин волн так называемого «водяного окна» (2.2-4.3 нм), в котором линейный коэффициент поглощения в углероде на порядок больше чем в воде.
Вместе с тем, остаются области рентгеновского диапазона длин волн, где успехи в создании оптических элементов и достижении субмикронного разрешения нс так велики. Это относится в первую очередь к коротковолновому диапазону (Х<1нм). Поэтому одной из целей наших исследований является разработка, проектирование и испытание зонной пластинки Френеля для работы в диапазоне длин волн 0.05-0.3 им. Создана теория дифракции в слоистой структуре, позволяющая рассчитывать оптимальные материалы и толщину
6
зонной пластинки. Изготовлена и успешно протестирована первая зонная пластинка из материалов Си-Сг.
Исторически первые рентгеновские снимки были получены контактным способом, то есть непосредственным прикреплением объекта к рентгеночувствительной пленке без всякого зазора [1] сразу вслед за открытием рентгеновского излучения в 1895 году [2]. Такой метод исследования при использовании биообъектов также называют микрорадиографией или радиографией (термин ввел Goby в 1913 году [3][4]). В настоящее время большая часть работ но контактной микроскопии проводится в «водяном окне» и лишь единичные исследования в более коротковолновой области спектра. Современные способы приготовления образцов и использование новейших фотоматериалов позволили нам использовать микрорадиографию в жестком рентгеновском диапазоне для демонстрации возможностей метода наблюдать скрытые детали и для решения практической задачи (исследование процесса деминерализации костной ткани). Во всех случаях мы старались добиться наилучшего разрешения, связывая дальнейший прогресс в этой области с развитием рентгеновской оптики (зонных пластинок Френеля).
Рентгеновская микроскопия в применении к задачам биологии (в частности, контактная) проложила своеобразный мост между электронной и оптической микроскопией. Если оптическая микроскопия не разрушает исследуемый образец, то электронная несет большую дозу облучения, вызывая нагрев и радиационную деградацию материала, что может привести к искажению получаемой информации. В сравнении с электронной, рентгеновская микроскопия на больших длинах волн (Х>4.4 нм) облучает образец сильнее для получения того же разрешения, в "водяном окне" (4.4>А>2.3 нм) дозы примерно сравниваются, а в более коротковолновой области рентгеновское излучение наносиз образцу меньший ущерб [5]. Такая же картина наблюдается в разрешении. Рекорд разрешения в рентгеновской микроскопии принадлежит контактной микроскопии и составляег 0.04 мкм в «водяном окне» при использовании резиста пол и метил метакрилат (РММА), что меньше, чем у электронной микроскопии, но больше, чем у оптической 161.
7
Варьируемая глубина проникновения в исследуемое вещество от 10 до 1000 мкм в диапазоне длин волн 0.05-0.3 нм делает этот участок спектра особенно важным при исследовании надклеточных образований. Ведь объекты такой толщины, как правило, непрозрачны в видимом участке спектра. За счет большой глубины резкости, обусловленной малой /ушной волны, возможна трехмерная реконструкция биологических тканей методом микрогомографии (с получением большого числа проекций). Мы ставили целью продемонстрировать возможность получения стереоизображений (две проекции), которые позволяют в перспективе изучать объект в развитии и движении и открывают путь к пониманию механизмов межклеточных взаимодействий, что и является основной задачей рентгеновской микроскопии в биологии.
Рентгеновские методы могут бьпъ интересны не только при работе с биологическими образцами. Впервые исследованы полимерные пленки -трековые мембраны с помощью рентгеновского микроскопа с объективом Шварцшильда в качестве оптического элемента на длине волны 20 нм. Исследованные мембраны трудно наблюдать как в оптический микроскоп (низкое разрешение, дифракция внутри поровых каналов), так в более коротковолновой рентгеновской области (большое пропускание полимерной матрицы). При этом поверхность мембраны не подвергалась дополнительной обработке, а достигнутое разрешение выше, чем у микроскопов видимого диапазона.
При участии автора создана механическая основа рентгеновского микроскопа для исследований в жестком рентгеновском диапазоне. Для этой цели был модернизирован разработанный в 1969 году в СКБ Института кристаллографии малоугловой дифрактометр АМУР-1. Создана автоматизированная приставка к дифрактометру, отвечающая современным требованиям к точности перемещений и позволяющая использовать прибор в схемах сканирующего рентгеновского микроскопа, пропускающего рентгеновского микроскопа, а также для контактной микроскопии, в том числе и для большого числа проекций.
8
Глава 1. Литературный обзор: «Контактная микроскопия», «Зонные пластинки Френеля жесткого рентгеновского диапазона»
1.1 Введение.
Опишем кратко четыре диапазона длин волн рентгеновского излучения*. Различные диапазоны определяются глубиной проникновения, контрастом разных биоорганических тканей друг относительно друга, методами подготовки биообъектов, применяемой оптикой, источниками и приемниками рентгеновского излучения и методами обработки получаемой информации.
Сверхжесткое излучение (длина волны менее 0.05 нм)* . Характеризуется очень высокой проникающей способностью в биологические ткани [71, слабым контрастом органических тканей (за исключением кальцинированных), падающем с ростом энергии фотонов [81. Для увеличения контраст изучаемых гканей часто применяют специальные вещсства-контрастеры - безвредные соединения с высоким содержанием тяжелых элементов [7]. Широко применяется в медицине. Работы в данном диапазоне осложняются как отсутствием отражающей либо пропускающей оптики, так и невысоким разрешением детекгоров данного типа излучения (лучшая медицинская рентгеновская пленка имеет разрешение не выше 10 мкм). Такое излучение распространяется в воздухе практически без поглощения (длина свободного пробега фотона с длиной волны 0.05 нм в воздухе составляет около 50 метров).
Примечание.* Ввиду того .что до настоящего времени нет устоявшегося деления отрезка длин волн короче 30 нм на диапазоны, автор считает целесообразным ввести следующее разделение для лучшей систематизации излагаемого материала. Названия диапазонов могут не совпадать с обозначениями авторов некоторых статей, так, в частности, излучение с длиной волны 0.5-3 А в литературе часто называют мягким рентгеновским излучением. Примененное разделение имеет смысл только когда речь идет о рентгеновской микроскопии.
Примечание.** Связь между длиной волны и энергией фагонов дается выражением А(нм)=1239.85/Е(эВ).
9
Жесткое излучение (0.05-0.3 нм). Излучение в этом диапазоне обладает высокой проникающей способноегью (от 10 мкм до 10 мм) в органические ткани. Наблюдается хороший контраст между тканями специально подготовленных (в частности, лиофилизированных) объектов, а также для некоторых тканей в естественной среде [8]. Характерная глубина проникновения определяет круг задач, которые возможно решать в приведенном диапазоне длин волн - надклеточные исследования внутренних органов животных и человека, в том числе in vivo, в динамике, трансформации и росте. Применение ограничивается слабым развитием оптики данного диапазона. В настоящее время наметился прогресс в создании изображающей оптики (в первую очередь, Брэгг-Френелевской оптики |9] и зонных пластинок Френеля [10][ 11 ]). К преимуществам диапазона следует отнести отсутствие необходимости в создании вакуума на оптическом пути (длина свободного пробега кванта в воздухе на длине волны 0.229 нм составляет около 35 см) и относительную дешевизну источников рентгеновского излучения (как правило мощности отпаянной рентгеновской трубки бывает достаточно [12][13], однако встречаются работы, где в качестве источника используется синхротрон [7][8]).
Диапазон "водяного окна" (от 2.3 до 4.4 нм). В этом диаггаюне длин волн длина свободного пробега фотона в углероде на порядок меньше, чем в воде (на длине волны 3.6 нм в углероде 0.13 мкм, в воде 3.2 мкм), что дает возможность наблюдать живые влажные объекты, проникая сквозь голщу окружающей их жидкости, в основном состоящей из воды. Глубина проникновения в этих случаях от 1 до 10 мкм, что по порядку величины совпадает с размерами бактерий и клеток. Контраст для тканей без предварительной обработки (живых или влажных) лучше, чем в жеегком диапазоне длин волн, однако тоже не всегда достаточен, в
10
первую очередь из-за большого процентного содержания воды внутри исследуемой клетки [14]. Этот диапазон наиболее широко используется в микроскопии биообъектов, что связано с широким развитием как оптики (зонные пластинки Френеля), источников рентгеновского излучения (синхротроны [7][15], минисинхротроиные станции [16], рентгеновские лазеры [17], лазерно-плазменные источники [18]{в том числе и на эксимерных лазерах [19]}), так и приемников рентгеновского излучения (РИ) (рентгеночувствительная фотопленка {разрешение 1-2 мкм [13]}, резисты {разрешение до 0.04 мкм [20]}, а также электролюминисцентные детекторы {разрешение 0.2-0.5 мкм}[7]). Недостатком диапазона является слабая вариация глубины проникновения фотонов в вещество , не позволяющая исследовать биологические объекты большего масштаба (длина свободного пробега в углероде на длине волны 2.4 нм-0.4 мкм , 4.3 нм-0.1 мкм). Кроме того, работы в диапазоне "водяного окна" требуют создания вакуума на оптическом пуги, а источники требуемой мощности конструктивно сложны и имеют высокую стоимость [20]. Излучение в интервале длин волн 0.3-2.3 нм и более 4.4 нм (мягкое рентгеновское излучение). Несмотря на то, что коэффициенты поглощения в углероде и воде близки, широкий выбор длин волн может обеспечить необходимый контраст и оптимальную глубину проникновения в исследуемое вещество [21]. Применение в основном обусловлено наличием мощных источников РИ в приведенном диапазоне, в первую очередь, это лазерно- плазменные источники с мишенями из золота и вольфрама [22], синхротрон, а также рентгеновские лазеры [23]. Изображения регисгрируют на резисте. Развита отражающая оптика нормального падения на основе многослойных зеркал (А,>4.4 нм), двухзеркальные объективы Шварцшильда [24]. Для повышения разрешения разрабатываются многозеркальные схемы, но они
1)
находят применение по большей части в области миісролитографии (производства микросхем) [25].
Данные по четырем диапазонам длин волн для рентгеновской микроскопии систематизированы в таблице 1.
1.2. Контактная микроскопия.
Контактная микроскопия - наиболее простой и доступный способ получать изображения в тех диапазонах длин волн, где отсутствует качественная оптика. Между тем и в диапазонах с развитой оптикой («водяное окно») контактная микроскопия по-прежнему применяется, так как сохраняет ряд преимуществ (малое время экспозиции и минимальная доза облучения для исследуемой ткани)[5].
1.2.1.Техника контактной микроскопии. Источники рентгеновского излучения
• Синхротрон. Наиболее универсальный источник рентгеновского излучения. Принцип действия: Пучок электронов в вакууме движется по кольцу в магнитном поле, излучая при этом фотоны разных энергий. Чем выше напряженность магнитного поля, тем больше спектр излучения сдвинут в коротковолновую область. Напряженность магнитного поля ограничивает и пороговое значение длины волны. Плотность потока фотонов на несколько порядков больше, чем у самой мощной трубки с вращающимся анодом 0X6 [8]. Преимущества синхротрона: высокая интенсивность, квазинепрерывность, малая угловая расходимость, широкий спетральный диапазон. На длине волны 0.154 нм яркости лазерно-плазменного источника и синхротрона примерно равны [26], при более длинных волнах («водяное окно») лазерно-плазменный источник в несколько раз ярче. Синхротрон широко используется в сканирующей микроскопии в "водяном окне", где в качестве фокусирующего элемент нрименяегся зонная пластинка Френеля [27]. Для контактной микроскопии не
Таблица 1.4 диапазона длин волн рентгеновского излучения.
Диапазоны Глубина проникновени я Источники Приемники Оптика Круг задач
< 0.05 нм сверхжссткос излучение > 10.мм Рентгеновские трубки Регпгсновская фотопленка Нет Прикладная медицина
0.05-0.3 нм жесткое излучение 10 МКМ -10 мм Рентгеновские трубки, синхротроны Рентгеновская фотопленка. CCD детекторы, элсктро- люмннисцентный детектор Зонные пластинки Френеля, Брэгг-Френелевская оггпгка Надклеточные исследования специально подготовленных объектов
2.3-4.4 нм «водяное окно» 1-10 мкм Синхротроны, минисинхротронные станция, рентгеновские лазеры, лазерно- плазменные источники Рентгеновская фотопленка, резисты, электро-люминисцентный детектор Зонные пластинки Френеля. отражающая оггпгка Специально подготовленные или натуральные клетки и бактерии
>4.4 нм Мягкое рентгеновское излучение < 1 мкм Синхротроны, лазерно-плазменные источники, рентгеновские лазеры Резист Отражающая многослойная оптика Специально подготовленные клетки или детали клеток
13
самый удачный из возможных источников. Это связано с тем, что биологическая ткань деградирует под действием рентгеновского излучения, поэтому требуется получить изображение за минимально возможное время. В связи с тем, что чувствительность высокоразрешающих резистов невелика, для контакгной микроскопии в "водяном окне" предпочтительным является источник с ультракоротким импульсом и большой мощностью. Таким является лазерно- плазменный источник.
• Лазерно-плазменный источник [28]. Принцип действия: на мишень (обычно это С или т.к. у них наибольшая доля энергии переизлучается в "водяном окне") фокусируется очень короткий лазерный импульс (0.5-5 не) с энергией 1-10 Дж. Образовавшаяся плазма служит мощным короткоимпульсным источником рентгеновского излучения. В зависимости от материала мишени спектр может быть непрерывным (Ие) или линейчатым (А1). Современный лазерно-нлазменный источник описан в работе [29].
• Минисинхротронныс станции [16]. Аналог синхротрона, но с меньшей энергией электронов, что ограничивает длину волны. В описанной автором минисинхротронной станции пороговое значение энергии электронов в 650 МэВ ограничило длину волны 1.3 нанометрами.
• Импульсно-плазменный источник [30]. Плазменный фокус образуется на оси газоразрядной камеры при радиальном сжатии пинчевых разрядов до очень малых размеров. Источник энергии - постоянный ток, протекающий через плазму. Процесс эволюции фокуса сопровождается генерацией мягкого рентгеновского излучения. Излучение происходит в широком диапазоне длин волн, но наибольший энергетический выход стремятся получить в «водяном окне». В настоящее время для контактной микроскопии живых объектов практически не применяется, т.к. длина импульса больше, чем у лазерно- плазменного источника при той же мощности. В статье
14
[31 ] описан коммерческий источник ’LEXIS II1, обычно применяемый в литографии с мощностью импульса 10 Дж за 200 не.
• рентгеновский лазер. Впервые лазерная генерация в рентгеновском диапазоне зафиксирована в 1985 году [32], наименьшая длина волны рентгеновского излучения составляла 182 А. С этим лазером проводились эксперименты по контактной микроскопии, (см., например, [23]). Однако длина волны была слишком велика для получения качественных изображений. Работы по получению генерации на длине волны 4.483 нм, а также на длине волны 3.56 нм, то есть внутри "водяного окна", описаны в статье [17]. Излучение монохроматическое с яркостью примерно на 7 порядков выше, чем у синхротрона. Недостатком лазеров является их м&тая мощность, (около 1 мДж за импульс, t=250 пс), а также высокая цена (примерно 10 млн. долл.), что равно цене канала синхротрона.
• Рентгеновская трубка. Самый сгарый и широко распространенный рентгеновский источник с непрерывной генерацией излучения. В рентгеновской микроскопии часто заменяется более мощными источниками из-за слишком большого времени экспозиции при работе с живыми клетками и тканями (десятки часов). Тем не менее, большое число работ было выполнено именно на рентгеновских трубках [15],
[33], [34], [35], [36], [37].Сменой материала анода можно получать излучение в широком диапазоне длин волн . Трубки использовались и российскими учеными [12], [38]. В статье [38] описывается растровая трубка с управляемым электронным лучом разработанная специально для рентгеновском контактной микрорадиографии.
Рентгеновская микрофокусная трубка является гакже хорошим источником для проекционной теневой микроскопии [143] (объект располагается возможно ближе к трубке и на некотором удалении получают увеличенное изображение с разрешением близким к размеру источника). В России такой микроскоп разработан в Институте машиноведения Б.М.Ровинским, В.Г.Лютцау и А.И.Авдеенко в 1969 году. Разрешение указанного микроскопа около
0.5-1 мкм.
Детекторы рентгеновского излучения для контактной микроскопии:
• Фотопленка. Фотопленка является наиболее чувствительной к рентгеновскому излучению, но обладает и наименьшим разрешением. Иснользуегся в основном при длинах волн менее 1.0-1.5 нм, когда
- Київ+380960830922