Исследование роли парамагнитных интермедиатов в биологически важных процессах методами спиновой химии и химической радиоспектроскопии

Оглавление
- ВВЕДЕНИЕ......................................................................-5
- ГЛАВА 1. Экспериментальная часть.............................................-14
1.1. Измерение и анализ стационарных эффектов ХПЯ в сильных магнитных полях -14
1.2. Измерение время-разрешенных эффектов ХПЯ в сильных магнитных полях......-17
1.3. Измерение и анализ эффектов ХПЯ в слабых магнитных полях................-18
1.4. Метод РУРЯЯ с временным разрешением для измерения кинетических параметров
образования и гибели корогкоживущих радикальных пар.....................-23
1.5. Метод ЭПР со спиновыми ловушками как инструмент для измерения скоростей
радикальных реакций.....................................................-23
1.6. Методы измерения стехиометрии и констант стабильности комплексов включения
органических соединений.................................................-27
- ГЛАВА 2. Исследование механизмов окисления синтетических аналогов ЫАОП -33
2.1. Введение................................................................-33
2.2. Фотоокисленис 1,4-дигидропиридинов хинонами.............................-34
2.3. Исследование парамагнитных интермедиатов методами СПЯ и ХПЯ в слабых магнитных полях.........................................................-38
2.4. Фотоокисление Ы-ацетил замещенного 1,4-дигидропиридина в растворе -42
2.5. Заключение..............................................................-48
- ГЛАВА 3. Изучение механизмов фотоизомеризации замещенных полиенов в растворах в
присутствие доноров и акцепторов электрона................................-50
3.1. Введение................................................................-50
3.2. Фотоиндуцированная изомеризация а.р-ненасыщснных кстонов................-51
3.3. Фотоизомеризация ретиналя...............................................-59
3.4. Фотоиндуцированные превращения изомеров р-ионона в растворах............-70
3.5. Заключение.............................................................-100
- ГЛАВА 4. Окислительно-восстановительные реакции каротиноидов................-101
4.1. Введение...............................................................-101
4.2. Окислительно-восстановительные реакции каротиноидов с хинонами и ионами металлов....................................................................-103
4.3. Реакции каротиноидов со свободными радикалами. Антиоксидантные свойства каротиноидов................................................................-107
2
4.4. Роль процессов с переносом электрона в про-оксидантиой активности каротиноидов...................................................................-116
4.5. Заключение.............................................................-124
ГЛАВА 5. Попытка моделирования элементарных стадий лиганд-рецепторньтх
взаимодействий..........................................................-126
5.1. Постановка задачи......................................................-126
5.2. Моделирование взаимодействия нифедипина с кальциевым рецептором с использованием методов спиновой химии..............................-127
5.3. Изучение механизмов фотоиндуцированных окислительно-восстановительных процессов с участием природного алкалоида лаппаконитина.................-140
5.3.1. Изучение механизмов фотоиндуцированных окислительно-восстановительных процессов в реакциях лаппаконитина с индивидуальными
аминокислотами...........................................................-140
5.3.2. Изучение механизма фототрансформации лаппаконитина методами ХПЯ и ЯМР..................................................................-152
5.4. Выводы и биологическое значение результата.............................-165
ГЛАВА 6. Исследование кинетических закономерностей поведения радикальных пар в
мицеллярных растворах с использованием импульсной микроволновой накачки электронных переходов в РП...........................................-167
6.1. Введение...............................................................-167
6.2. Описание методики......................................................-168
6.3. Изучение динамики радикальных пар в мицелярных растворах...............-174
6.4. Исследование структуры и динамики мицелл с использованием время-разрешенного метода РУЕЗЯ. Влияние температуры и концентрации соли на структуру
и динамику мицеллы.......................................................-178
6.5. Фотохимия ацетиленовых кстонов в ЗОБ мицеллах. Влияние внешнего магнитного поля на выход радикальных продуктов реакции.............................-189
6.6. Заключение........................................................:....-200
ГЛАВА 7. Влияние организованной среды на окислительно-восстановительные
процессы с участием биологически активных соединений....................-202
7.1. Введение...............................................................-202
7.2. Строение и реакционная способность комплексов включения каротиноидов с циклодекстринами.........................................................-203
7.3. Супрамолекулярные комплексы каротиноидов с глицирризиновой кислотой...-221
7.4. Изучение комплексообразования нифедипина с глицирризиновой кислотой. ...-237
7.5. Исследование влияния комплексообразования на реакционную способность
лаппаконитина.....................................................-245
7.6. Выводы и биологическое значение результатов......................-251
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ............................................-253
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................-254
4
Введение.
В последнее десятилетие произошел качественный скачок в исследовании химических процессов происходящих в живой природе. Этот прогресс характеризуется, прежде всего, переходом с макро уровня на микро уровень в понимании механизмов этих процессов. Особый прогресс был достигнут в биологии и медицине, свидетельством чему является присуждение Нобелевских премий по медицине в последние годы. Немалая заслуга в этом принадлежит, несомненно, развитию и применению новых физических методов исследования биологически важных процессов. В настоящей работе с помощью современных физических методов исследована роль парамагнитных интермедиатов ряда конкретных биологически активных соединений в процессах, представляющих практический интерес для биологии и медицины. Это - окисление 1,4-дигидропиридинов - аналогов кофермента ИЛОН, лиганд-рецепторное взаимодействие, цис-транс изомеризация полиенов, антиоксидантная активность карогиноидов, а также фотостабильность и фототоксичность ряда лекарственных препаратов.
Современные физические методы позволяют не только изучать структуру продуктов конкретных биохимических процессов, но и получать новую информацию о структуре и* временах жизни короткоживущих интермедиатов этих реакций, а также о механизмах процессов на молекулярном уровне. Широкое применение в биологии и-медицине нашли структурные методы.исследования. В частности, методы химической радиоспектроскопии (ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)) позволяют исследовать структуру и динамику сложных биологических молекул и их парамагнитных форм. В настоящее время эти методы применяются для исследования структуры белков, олиго- и поли-нуклеотидов и других биополимеров. Поскольку биологическая активность биополимеров напрямую связана с их пространственной структурой, эти данные имеют огромное практическое значение, в частности, для понимания механизмов работы клеточных рецепторов и для создания новых более эффективных лекарственных форм.
Наряду со структурными методами широкое развитие получили кинетические методы исследования химических процессов. Большая часть этих методов основана на импульсной инициализации реакций с последующей регистрацией временной эволюции исходных соединений или продуктов реакции (конечных и промежуточных). Наибольшим временным разрешением обладают фотохимические и радиационные методы генерации химической реакции. Помимо огромного разнообразия фотохимических процессов происходящих в живой природе, эти методы позволяют генерировать и изучать свойства промежуточных парамагнитных интермедиатов, про которые известно, что они
5
образуются в темновых реакциях в живых клетках. Моделирование, в частности, ферментативных процессов с помощью фотохимической генерации позволяет повысить концентрацию короткоживущих парамагнитных интермедиатов, и тем самым облегчает их регистрацию. Такой же цели нередко служит проведение реакций в так называемых организованных средах (мицеллы, комплексы «гость - хозяин», и др.). Известно, что большинство фотохимических процессов и многие ферментативные процессы протекают по радикальному механизму. В настоящей работе автор также будет прибегать к такого рода моделированию, т.е. исследовать модельные фотопревращения биологически важных молекул, а также их реакции в организованных средах.
Целыо настоящей диссертационной работы являются исследования методами спиновой химии и химической радиоспектроскопии роли корокоживущих парамагнитных интермедиатов, образующихся в процессах с участием биологически важных молекул в растворах и организованных средах. В качестве объектов исследования выбраны 1,4-дигидропиридины - синтетические аналоги NADH, природные полисны, включая рстиналь, являющийся частью зрительного пигмента родопсина, и каротиноиды, а также биологически активные карбонильные соединения и некоторые лекарственные препараты. Выбор объектов, определяющий во многом актуальность и практическую- значимость представленной работы связан со следующими обстоятельствами. Все выбранные соединения, или их природные аналоги, участвуют в биологических системах в окислительно-восстановительных превращениях, механизмы которых не были установлены, ранее. И именно роль парамагнитных частиц в этих процессах, являлась, а кое-где является и поныне, предметом дискуссии.
В настоящее время методики спиновой химии занимают важнейшее место в исследованиях процессов с участием радикальных частиц. Эти методы основаны на явлении химической поляризации ядер (ХПЯ) и электронов (ХПЭ), а также на явлении влияния магнитного поля на радикальные химические процессы, открытые в семидесятые годы группой новосибирских и московских ученых (открытие № 300 «Закономерность радикальных химических процессов», авторы: А.Л. Бучаченко, Э.М. Галимов, Т.В. Лешина, Ю.Н. Молин и Р.З. Сагдеев). К преимуществам этих методов относится их более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методами ЯМР и ЭПР, а также высокая информативность. Так, метод ХПЯ позволяет одновременно получать информацию о парамагнитных интермедиатах, конечных продуктах реакции, и кинетике отдельных стадий.
Говоря о преимуществах тех или иных методов исследования, нельзя не отметить, что каждый метод имеет и свои ограничения, и по области применения, и по
чувствительности, и по временному разрешению. Поэтому каждый метод в отдельности, как правило, не дает всей необходимой информации о процессе, особенно для таких сложных объектов, какими являются биологические системы. Для более глубокого изучения механизмов сложных процессов необходимо применение комбинации различных методов, а также создание новых методик и экспериментальных установок, наилучшим образом подходящих для решения конкретной задачи. В представленной работе значительное внимание уделяется разработке и применению комплексного использования современных физико-химических методов для исследования биологически важных процессов. Особое внимание уделено время-разрешенным методам спиновой химии в сочетании с оптической спектроскопией, ЭПР и ЯМР в стационарном и импульсном вариантах. Подробному описанию используемых в этих исследованиях экспериментальных установок и методических подходов посвящена Глава 1 диссертации. Основная часть работ выполнена в лаборатории Магнитных явлений Института химической кинетики и горения СО РАН на ЯМР' спектрометрах фирм Varian, Bruker и Jeol с различной напряженностью магнитного поля, снабженных стационарными и импульсными источниками света для проведения фотохимических экспериментов и регистрации эффектов ХПЯ. Кроме того, часть работ выполнена автором диссертации в рамках международного сотрудничества с коллегами из Латвии, США и Японии: Мы благодарны коллегам из Латвии за синтез широкого набора замещенных 1,4-дигидропиридинов - аналогов природного кофермеита NADH. В. содружестве с Университетом штата Алабама, США (Проф. Л.Д. Кисперт), выполнен цикл работ, посвященный исследованию окислительно-восстановительных процессов с участием широкою набора каротиноидов и их супрамолекулярных комплексов. Совместно с группой Д-ра Оказаки (National Industrial Research Institute of Nagoya, Japan) создан врсмя-разрешенный вариант метода PYESR (product-yield-detected-ESR) для исследования динамики радикальных пар и магнитных эффектов, в организованных средах. В проведении расчетов участвовали сотрудники лаборатории Теоретической химии ИХКГ СО PAII, Проф. Счастнев Г1.В. и Башурова B.C..
Главы 2-7 настоящей диссертации посвящены описанию конкретных исследований процессов с участием биологически важных соединений с использованием набора физических методов. При этом результаты работы поделены на две части: исследование процессов в гомогенных растворах (главы 2-5) и в организованных средах (комплексы «хозяин - гость» и мицеллы, главы 6-7).
Вторая глава диссертации посвящена исследованию процессов с переносом электрона в реакциях 1,4-дигидропиридинов (ДГП) — синтетических аналогов природного
7
!
1
кофермента ЫАОН. Дискуссия о возможностях гетеролитического и гомолитического механизмов превращения этого соединения в живых системах не утихает последние несколько десятилетий. В настоящей работе исследования проводились с использованием различных методов спиновой химии: ХПЯ в сильных и слабых магнитных полях, ХПЯ с временным разрешением, а также СПЯ (стимулированная поляризация ядер). Исследование модельных реакций фотоиницированного окисления целого ряда замещенных 1,4-дигидропиридинов в присутствии различных акцепторов электрона и сравнение фотоинициированных и темновых процессов позволило установить роль радикальных частиц в этих процессах. В частности, удалось проследить за всеми тремя стадиями процесса превращения ДТП в пиридин: последовательный перенос электрона, протона и атома водорода, или электрона, протона, электрона). Сравнения эффектов ХПЯ ряда замещенных ДГП показали, что механизм реакции существенно различается для М-замещенных и N-незамещенных ДГП. Для того, чтобы установить как зависит механизм реакции от физико-химических параметров системы, от полярности среды и структуры молекулы ДГП, был изучен фотолиз различных синтетических Ы-замещенных и И-незамещенпых ДГП в полярной и неполярной средах.
Следующий цикл работ посвящен исследованию механизмов цис-транс изомеризации полиненасыщенных соединений. Этот вопрос подробно освещен в Главе 3 диссертации. В- этой главе описаны механизмы* цис-транс изомеризации, полисное, включающие стадию переноса электрона. В! отличие от оптических методов исследования, методы ЯМР и ХПЯ позволяют раздельно наблюдать сигналы от разных изомерных форм, что позволило нам впервые применить эти методы для исследования механизмов изомеризации сложных молекул содержащих несколько сопряженных двойных связей. Следует отметить, что доказательство участия одноэлектронного переноса в процессе цис-транс фотоизомеризации замещенных этиленов в присутствие доноров и акцепторов электрона впервые было получено именно методами спиновой химии и это считается одним из важных её достижений. Изучение свойств ион-радикапов природных полиенов в настоящее время приобретает особую актуальность, поскольку они входят в состав многих биологических систем, в которых идут процессы цис-транс изомеризации, предположительно с переносом заряда. Так, например; 11 -цис рстинапь является хромофором зрительного пигмента родопсина. Считается, что его цис-транс изомеризация инициирует процесс зрительного восприятия в глазу человека и других млекопитающих. В представленном цикле работ получены экспериментальные доказательства участия следующих промежуточных короткоживущих частиц в реакциях цис-транс изомеризации полиенов: триплетные возбужденные состояния, образующиеся
8
при рекомбинации триплетной нон-радикальной пары; катион-радикалы и дикатионы; а также вторичные интермедиаты образующиеся из ион-раднкалов: нейтральные радикалы и бирадикапы. Для каждого из описанных вариантов установлен детальный механизм изомеризации.
Примером комплексного подхода к изучению биологически важных процессов является исследование окислительно-восстановительных реакций каротиноидов, описанное в четвертой главе. В представленном цикле работ, выполненных с использованием различных физико-химических методов исследования (ЯМР; ЭПР (включая импульсные методики), ХШІ, ВЭЖХ, электрохимия, оптическая спектроскопия и флюоресценция) изучен ряд окислительно-восстановительных процессов с участием природных и синтетических каротиноидов. Известно, что каротиноиды являются одним из самых распространенных классов пигментов в природе. Они синтезируются растениями и микроорганизмами и присутствуют во многих пищевых продуктах, включая овощи, фрукты и рыбу. В большинстве природных процессов, включая фотосинтез, их роль чаще всего связывают с реакциями переноса энергии и электрона. В медицине интерес к каротиноидам связан, прежде всего, с их антиоксидантиыми свойствами. Сегодня антиоксиданты, и в частности каротиноиды, используются на практике в комплексном лечении таких серьезных заболеваний.как рак, болезни сердца, нервной системы, а также возрастные дегенеративные изменения мышечных тканей. В связи с упомянутым-интересом к антиокендантным свойствам каротиноидов можно утверждать, *гго именно химические и физико-химические исследования реакционной способности каротиноидов в окислительно-восстановительных процессах в настоящий момент являются приоритетными. Сегодня исследователи разных специальностей, от физиков и химиков, до биологов и медиков, заняты выяснением природі,і основных факторов, определяющих их антиоксидантную активность. Имеющаяся в литературе информация о короткоживущих парамагнитных и диамагнитных интермедиатах, образующихся в реакциях каротиноидов со свободными радикалами, весьма ограничена, а структура интермедиатов, как правило, только предполагается. Поэтому именно на исследования, связанные с реакционной способности каротиноидов, а также их короткоживущих парамагнитных интермедиатов были направлены работы, описанные в настоящей главе диссертации. Показано, что в зависимости от условий эксперимента и природы каротиноида они могут проявлять как антиоксидантныс, гак и про-оксидантные свойства. При этом, антиоксидантная активность каротиноидов напрямую связана с их восстановительной способностью.
В пятой главе диссертации описан развитый в рамках настоящей работы оригинальный подход к изучению механизмов лиганд-рсцспторных взаимодействий на молекулярном уровне на примере моделирования взаимодействия ряда лекарственных препаратов и их комплексов с активными центрами рецепторов. Понимание механизмов терапевтического действия лекарственных препаратов на молекулярном уровне является одной из важнейших задач биохимии и фармакологии. Успешное решение этой проблемы имеет принципиальное значение не только для фундаментальной науки. Понимание механизма взаимодействия лекарства с клеточным рецептором может стать определяющим фактором при разработке новых лекарственных средств. Вот почему в последние годы стали появляться работы направленные на изучение механизмов процессов происходящих в активных центрах клеточных рецепторов на молекулярном уровне, постепенно вытесняя широко используемый до этого макроскопический подход. Представленный экспериментальный подход основан на моделировании с помощью физических методов отдельных стадий процесса взаимодействия лекарства с аминокислотами, остатки которых располагаются в активных центрах клеточных рецепторов. Основой для построения модели послужили приведенные В' литературе расчеты, указывающие на образование донорно-акцепторного комплекса между молекулой гипотензивного препарата - нифедипина и аминокислотой - тирозином, располагающимся в активном сайте кальциевого рецептора. В работе было предположено, что в таком комплексе может происходить одноэлектронный перенос. Данная гипотеза-была проверена и получила экспериментальное подтверждение на примере двух лекарственных препаратов: нифедипина - блокатора кальциевых рецепторов, и лапаконитина - блокатора натриевых каналов. Механизм взаимодействия между молекулами лекарств и аминокислотами тирозином и триптофаном, входящими в активные центры соответствующих рецепторов, изучен методами ядерного магнитного резонанса и химической поляризации ядер, включая версию с временным разрешением. Доказано, что первичной стадией процесса в обеих системах действительно является перенос электрона. Показано, что анион-радикалы обоих лекарственных соединений нестабильны и быстро (в микросекунд ном временном диапазоне) превращаются в продукты, не способные к связыванию с рецептором. Этот факт важен, поскольку проливает свет на практически не изученную природу диссоциации комплекса лекарства с рецептором.
Отдельный интерес представляют результаты исследования фотохимии нифедипина и лаппаконитина в растворах в присутствие доноров и акцепторов электрона. Вопрос о фотостабильности лекарственных препаратов весьма актуален для фармакологии,
10
поскольку фотораспад приводит не только к уменьшению терапевтической активности препарата, но и может привести к образованию токсических продуктов или интермедиатов. Показано, что оба этих соединения фоточувствительны в УФ диапазоне и при фото возбуждении вступают в реакции переноса электрона с рядом аминокислот, а также другими органическими молекулами. Установлено, что результатом реакции является образование широкого набора И-, О-, и С-центрированных свободных радикалов и ион-радикалов нифедипина, лаппаконитина и партнеров. Кроме того, в триплетном возбужденном состоянии лаппаконитнн сам подвергается внутримолекулярному переносу электрона с образованием бирадикала. Детально описаны механизмы всех исследованных процессов. Не исключено, что именно короткоживущие парамагнитные интермедиаты являются причиной высокой токсичности лаппаконитина.
Во второй части диссертации (главы 6-7) описываются окислительно-восстановительные процессы с участием биологически активных соединений в организованных средах и развитый оригинальный подход для исследования кинетики процессов в организованных средах - мицеллах.
Шестая глава посвящена изучению динамики радикальных пар в мицеллярных растворах. Эта проблема представляет интерес, прежде всего, с точки зрения понимания механизмов межмолскулярных взаимодействий в системах с ограниченной подвижностью, к которым можно отнести практически все биологические системы. Отметим, что именно в таких системах были зарегистрированы значительные магнитные эффекты на выход продуктов реакции. В последние несколько десятилетий вопрос о влиянии слабых магнитных и электрических полей на живые системы привлекает внимание многих исследователей, включая медиков и биологов. Это связано как с фундаментальными проблемами понимания механизмов ориентации животных в магнитном поле Земли, так и с практическими задачами оценки возможного вредного воздействия современных диагностических и лечебных методов. Обнаружение в наших работах значительных магнитных эффектов (сотни процентов) на выход свободных радикалов в фотоинициированных процессах с участием ряда карбонильных соединений является наглядной демонстрацией, как актуальности этих проблем, так и реальности решения стоящих перед наукой задач.
В представленном цикле работ реализована идея об использовании импульсной микроволновой накачки электронных переходов в РП для получения кинетической информации о скоростях образования и гибели радикальных пар в мицеллах. Созданный в результате данной работы время-разрешенный импульсный вариант метода РУЕ8Я (ргос!ис1-у1с1сМс1ес1с(1-Е8Р.) обладает целым рядом преимуществ перед существовавшими
> 11
г
I
{
на тот момент методиками, использующими аналогичный принцип микроволновой накачки электронных переходов в РП. В работе были измерены кинетические параметры радикальных пар образующихся при фотолизе ряда карбонильных соединений (антрахинон и ацетилен-замещенные ароматические кетоны) в мицеллярных растворах, а также изучено влияние внешних факторов (температура и концентрация соли) на структуру и динамику самих мицелл. Отметим, что все исследованные системы представляют интерес и с точки зрения их биологической активности. Известно, что многие природные и синтетические антрахиионы и их производные обладают противоопухолевой активностью, а ацетиле![-содержащие кетоны используются как антшрибковые препараты.
В первой части следующей Главы затронуга проблема касающаяся комилексообразовання каротиноидов и влияния организованной среды на их реакционную способность в окислительно-восстановительных процессах. Известно, что такие свойства каротиноидов, как гидрофобность, высокая фоточувствительность и химическая активность, существенно затрудняют их применение на практике. Одним из путей решения подобных проблем в фармакологии является использование комплексов включения типа «гость-хозяин». Молекулы «гостя» в комплексе могут изменить свои-физические, химические и биологические свойства. Установлено, что комплексообразование может значительно увеличить стабильность и биодоступность включенных молекул. Работы представленные в диссертации можно считать пионерскими, поскольку в литературе практически отсутствовали данные, касающиеся физико-химических свойств комплексов включения каротиноидов. Интересной находкой в этом плане явилось использование в качестве молекулы «хозяина» р-глицирризиновой кислоты - природного соединения принадлежащего к тритерпеновым гликозидам. Показано, что комплексообразован ие с глнцирризиновой кислотой оказывает заметное воздействие на реакционную способность каротиноидов. Было зарегистрировано уменьшение скоростей переноса электрона в реакции с акцепторами, а также удлинение времени жизни катион-радикалов каротиноидов в комплексах, приводящее к изменению соотношения продуктов реакции. Экспериментально обнаружено многократное увеличение скорости захвата перекисных радикалов (антиоксидантная активность) каротиноидами в комплексе, и установлена причина этого явления. Следует отметить, что, несмотря на большой интерес к использованию комплексов включения с целью направленного изменения свойств включенных соединений, до сих пор остается открытым вопрос о природе влияния комплексообразования на их реакционную способность. Представленные в настоящей главе результаты исследований процессов
одноэлектронного переноса с участием комплексов каротиноидов, - это немногочисленные примеры попыток ответить на поставленные вопросы. Прежде всего, показано, что перенос электрона характерен для каротиноидов не только при их превращениях в фотосинтетических центрах, но и при взаимодействии со свободными радикалами, а также при цис-транс изомеризации. Можно констатировать, что именно склонность к одноэлектронному переносу объединяет наиболее важные биологические процессы с участием каротиноидов, начиная от фотосинтеза и фотоизомеризации ретиналя в составе зрительного пигмента родопсина, и кончая их антиоксидантной активностью.
В Главе 7 представлен также цикл работ, посвященных исследованию структуры и реакционной способности комплексов включения нифединина и лаппаконитина с. глицирризи новой кислотой. Поводом для данных исследований явилось экспериментальное обнаружение значительного (в десятки и сотни раз)' усиления терапевтической активности этих препаратов в присугствие глицирризиновой кислоты. Создание эффективных лекарственных препаратов на основе комплексов • включения • с природными« соединениями сегодня является бурно развивающейся* областью медицинской- химии. Использование комплексов- включения позволяет направленно' регулировать (усиливать или ослаблять) те или иные свойства лекарственных соединений. Используя оптическую и ЯМР спектроскопию (включая релаксационные методы) удалось показать, что глицирризиновая кислота, образует очень стабильные комплексы как с нифедипином, так. и с лаппаконитино.м. Показано, что комплексообразование повышает растворимость препаратов в воде и существенно снижает скорость фоторазложения нифедипина и лаппаконитина и выход свободных радикалов. Данный результат может иметь практическое значение для увеличения фотостабильности других лекарственных препаратов, увеличения их биодоступности и снижения токсичности (включая фототоксичность).
П. заключение отметим, что полученные в настоящей работе результаты могут представлять интерес для разных областей науки, (химическая физика, химия, биохимия, медицина). Кроме того, результаты, полученные во второй части диссертации, касающиеся повышению стабильности каротиноидов и лекарственных препаратов за счет комплсксообразования,- имеют несомненное практическое значение и будут небезынтересны для пищевой промышленности, косметологии и фармакологии.
13'
ГЛАВА 1. Экспериментальная часть.
1.1. Измерение и анализ стационарных эффектов ХПЯ в сильных магнитных полях.
Исторически применение метода ХПЯ для анализа механизмов сложных химических реакций началось именно со стационарного варианта этой методики в сильных магнитных полях [1]. Это было связано как с техническими трудностями - отсутствием импульсных ЯМР спектрометров высокого разрешения и соответствующих источников света (мощных импульсных лазеров с длиной волны излучения в УФ диапазоне), так и с относительной простотой теоретического описания ХПЯ в сильных магнитных полях. Работы, описанные в настоящей диссертации, проводились в лаборатории магнитных явлений Института химической кинетики и горения СО РАН. В течение последних двадцати лет установки для наблюдения ХПЯ постоянно совершенствовались, что связано в первую очередь с развитием приборной базы лаборатории и возможностью автоматизации эксперимента с использованием персональных компьютеров и современного математического обеспечения. Используемые установки можно условно разделить на два типа: с непрерывным и импульсным облучением образца. Установка первого типа создана на основе ЯМР спектрометра ШОЬ РХ-90(} (рабочая частота на протонах 90 МГц) с постоянным электромагнитом и ртутной лампой высокого давления ДРШ-500 в качестве источника света. Блок-схема установки представлена на Рисунке 1.1.
14
Рисунок 1.1 Блок-схема установки для наблюдения ХПЯ в сильном магнитном поле. (1) - ртутная лампа, (2) - тепловой фильтр, (3) - оптический фильтр, фокусирующая линза.
Главным преимуществом этой установки но сравнению с импульсным вариантом является возможность варьирования длины волны облучения образца путем использования набора оптических фильтров.
Установки второго типа были реализованы на базе импульсных Фурье спектрометров со сверхпроводящими магнитами АМ-250 и DPX-200 фирмы Bruker. В качестве источника света в этих установках использовался эксимерный лазер Lambda Physik EMG 101 MSC (X = 308 нм, длительность импульса 15 не, мощность 100 мДж). Блок-схема такой установки представлена на Рисунке 1.2.
Рисунок 1.2 Блок-схема установки для наблюдения ХПЯ в поле сверхпроводящего магнита. (1) - блок синхронизации, (2) - линза, (3) - призма-линза.
15
Данная установка позволяет регистрировать эффекты ХПЯ как в квази-стационарном, так и во время-разрешенном вариантах. В квази-стационарноч варианте облучение образца производится серией из восьми импульсов с интервалом 70 мс с последующей регистрацией. Специально созданная для этой цели импульсная последовательность [2] представлена на Рисунке 1.3.
РЧ импульсы 180° 90°
Спад свободной индукции
Импульсы
преднасыщения
Импульсы
лазера
Рисунок 1.3. Временная диаграмма эксперимента по наблюдению квази-стационарной XI1Я.
Использование данной импульсной последовательности позволяет полностью подавить равновесные сигналы ЯМР и регистрировать только сигналы ХПЯ. Данный прием оказывается особенно полезным в случае слабых изменений на фоне больших сигналов равновесного спектра ЯМР, а также при анализе сложных спектров с перекрывающимися линиями.
Во всех случаях для наблюдения ХПЯ в сильных магнитных полях облучение образца производится непосредственно в датчике ЯМР спектрометра в поле магнита. Так, для спектрометра ОРХ-200 напряженность поля составляет 47 кГс.
Анализ эффектов ХПЯ в сильных магнитных полях производится с помощью простых правил выведенных Каптейном и модифицированных Клоссом для ион-радикальных реакций [1, 3]. Согласно этим правилам, знак интегрального эффекта ХПЯ определяется знаком произведения следующих параметров:
Гп = рхе*Д§хах\ (1.1)
Где ц = +1 для гриилетного предшественника радикальной пары (РП), и -1 для синглетного; е = +1 для продукта геминальной рекомбинации РП («клеточный продукт») и
16
-1 для продуктов избежавших геминальной рекомбинации («внеклеточный продукт»); Ag - разница g-факторов радикалов пары; а - знак константы СТВ наблюдаемого ядра в радикале-предшественнике; и X - +1 для продукта рекомбинации синглетной РП и -1 для триплетной. Хотя данные правила являются универсальными, при анализе реальных систем необходимо помнить, что существуют ситуации, когда эти правила нарушаются. Это происходит, например, при наличии у одного из радикалов экстремально больших констант СТВ. Теоретически и экспериментально было продемонстрировано, что отклонение от правил Каптейна происходит, если в радикальной паре имеется одно ядро с константой СТВ |Аг| > |А|| и |AgHo| [4-6].
1.2. Измерение время-разрешенных эффектов ХПЯ в сильных магнитных полях.
Идея метода ХПЯ с временным разрешением была предложена Эрнстом в 1974 году [7]. Однако эта идея не была сразу реализована вследствие отсутствия мощных импульсных источников света. Бурное развитие метода началось в восьмидесятые годы [8,9] с появлением импульсных лазеров наносекундной длительности в УФ диапазоне с энергией импульса в десятки миллиджоулей, а также импульсных ЯМР спектрометров с Фурье-преобразованием [10,11]. Классическая импульсная последовательность для проведения экспериментов с временным разрешением представлена на рисунке 1.4.
Импульс
РЧ импульс лазера J
Спад свободной индукции
Импульсы преднасыщения Задержка т
Рисунок 1.4. Временная диаграмма эксперимента по наблюдению ХПЯ с временным разрешением.
Техника эксперимента основана на импульсном возбуждении ядерной спиновой системы с использованием широкополосного передатчика. На первом этапе происходит насыщение ядерных спиновых состояний молекул для подавления равновесных сигналов ЯМР. Сразу
17
после этого компьютер выдает сигнал на запуск лазера, импульс света которого запускает химическую реакцию. Через определенное время т компьютер выдаст радиочастотный регистрирующий импульс, создающий поперечную компоненту вектора намагниченности продуктов реакции. Регистрируемой величиной является спад свободной индукции, Фурье-преобразование которого дает спектр ЯМР поляризованных продуктов реакции образовавшихся за время т. Временное разрешение метода ХПЯ определяется длительностью импульса лазера (15 не в наших экспериментах) и длительностью радиочастотного импульса. Максимальная интенсивность сигнала ЯМР достигается при использовании 90°-го импульса, что соответствует длительности 5-7 мке для большинства спектрометров. Уменьшение длительности импульса приводит к соответствующему снижению чувствительности метода ЯМР. Как правило, в эксперименте используются регастрирующис импульсы длительностью 1 МКС.
Отметим, что метод ХПЯ с временным разрешением, обладает рядом преимуществ по сравнению с другими врсмя-разрешенными физическими методами, поскольку объединяет в себе высокое временное разрешение с высоким спектральным разрешением характерным для метода ЯМР. Так, временное разрешение импульсного метода ЭПР составляет десятки наносекунд, в то время как ширина линии в спектре ЭПР достигает десятков мегагерц. Оптические методы, отличаются еще более широкими полосами поглощения. Особенность метода ХПЯ заключается в том, что информация,о процессах происходящих в радикальной паре в наносекундном диапазоне сохраняется в-диамагнитных продуктах реакции в течение времени ядерной спин-решеточной релаксации, которая' для большинства органических молекул составляет несколько секунд. Таким образом; метод ХПЯ позволяет исследовать фотохимические процессы с временным разрешением в субмикросекундном диапазоне, сохраняя при этом высокое спектральное разрешение до долей герца характерное для спектроскопии ЯМР. Практически- это означает возможность раздельного наблюдения за временным поведением не только различных молекул, но и отдельных ядер в одной молекуле имеющих ненулевое сверхтонкое взаимодействие в радикале предшественнике.
Измерение временных зависимостей ХПЯ и сопоставление их с расчетом для известного механизма реакции позволяет получить количественную информацию о спиновой динамике радикальной пары, о кинетике химического процесса и о временах ядерной релаксации в радикалах [12-21].
18
1.3. Измерение и анализ эффектов ХПЯ в слабых магнитных полях.
Метод ХПЯ в слабых магнитных полях (МП) не получил столь широкого распространения как в сильных полях. Это связано как с более сложной технической реализацией эксперимента, так и с неразвитостью теории ХПЯ в слабых полях в восьмидесятые годы. Точные расчеты были возможны только для простейшей одноядерной модели, которая, конечно же, не описывала реальные радикальные пары. Последовательное теоретическое рассмотрение ХПЯ в слабых полях требующее учета как Б-То, так и Б-Т+ и Б-Т. переходов сопряжено с решением большого числа уравнений для элементов матрицы плотности РП. Для радикальных пар с большим числом магнитных ядер они становятся чрезвычайно сложными. Отметим, что с ростом числа магнитных ядер число уравнений возрастет как 2". В тоже время модельные расчеты с помощью одноядерной модели показали, что этот метод может дать некоторую дополнительную информацию о структуре и динамике радикальной пары по сравнению с экспериментом в сильных магнитных полях [1, 22]. В частности, анализ полевой зависимости ХПЯ дает информацию об абсолютном значении константы СТВ в радикале, в то время как соотношение интенсивностей поляризованных линий спектра ХПЯ в сильных МП дает информацию только об относительных величинах констант СТВ на различных ядрах в радикале - предшественнике поляризованного продукта. Кроме того, при проведении реакции- в организованной среде (например, в мицелле) или в бирадикале полевая зависимость ХПЯ дает информацию о величине электронного обменного взаимодействия-в радикальной паре, что, в конечном счете, может позволить оценить расстояние между радикалами. И третье существенное отличие от ХПЯ в сильных МП заключается в отсутствии-зависимости ХПЯ в слабых МП от величин д-факторов радикалов пары, что позволяет наблюдать поляризацию далее в РП с одинаковыми g-фaктopaми; что невозможно в сильных МП. Поэтому, применение метода ХПЯ в слабых МП в дополнение к сильным МП представлялось весьма заманчивым.
В связи с этим, большие усилия направлялись и направляются [23] на развитие теоретических подходов, позволяющих описать динамику радикальных пар в слабых полях для реальных многоядерных систем. Одной из первых таких попыток была работа Сарварова с соавторами в которой анализировалось выделенное ядро на одном радикале, а влияние ядер второго радикала учитывалось в виде некой эффективной константы СТВ [24]. Этот подход позволил выявить ряд интересных закономерностей. Во-первых, в отсутствие обменного взаимодействия клеточные и внеклеточные продукты имеют разные знаки поляризации. При 1о > А/4 все продукты поляризованы одинаково. Более того, когда обменное взаимодействие велико по сравнению с СТВ, поляризация любого
19
ядра формируется так, как если бы в РП было только это магнитное ядро. И, во-вторых, наличие дополнительных ядер в РП в отсутствие обменного взаимодействия существенно влияет на вид нолевой зависимости вплоть до смены знака поляризации.
1.3.1. Экспериментальные установки для измерения эффектов ХПЯ в слабых магнитных
полях.
Экспериментальные трудности изучения эффектов ХПЯ в слабых магнитных полях, обусловлены, во-первых, необходимостью проводить реакцию в отдельном магните с последующим переносом образца в датчик спектрометра. Но поскольку ядерная поляризация гибнет за времена порядка времени спин-решеточлой релаксации в молекуле (единицы - десятки- секунд), то необходимо осуществить перенос за время короче Ть Вторая трудность заключается в необходимости быстрой остановки реакции до начала переноса образца, что сильно затрудняет изучение термических реакций. Для сведения к минимуму экспериментальной погрешности измерения интенсивности ХПЯ нами были реализованы два различных подхода к созданию экспериментальной установки. Первая установка была изготовлена на базе ЯМР спектрометра XL-200 фирмы Varian со сверхпроводящим магнитом. Основная идея состояла в быстром перемещении ампулы с образцом по трубе соединяющей датчик спектрометра с отдельным магнитом расположенным точно над теплым отверстием соленоида. Блок-схема установки; которую мы назвали “Hopper” представлена на рисунке 1.5. На трубке с внутренним диаметром 12 мм монтировались устройство для вращения образца (2), электромагнит (3) соединенный с блоком управления (БУ), и шторка для сброса образца (4). Опускание образца, как и его поднятие вверх осуществлялось на воздушной подушке за 1-2 секунды во избежание повреждения датчика. Сам образец в стандартной ЯМР ампуле вставлялся в специальную турбинку обеспечивающую его вращение в течение всего эксперимента. Реакция запускалась сигналом компьютера через блок управления открывающий шторку ртутной лампы ДРШ-1000. Свет попадал на образец через кварцевое окошко в трубке, с предварительным проходом через тепловой и оптический фильтры.
20
Рисунок 1.5. Блок-схема установки “Hopper" для наблюдения Х11Я в слабых магнитных полях. БУ - блок управления; (1) - образец в турбинке; (2) устройство для вращения образца; (3) - электромагнит; (4) - шторка для сброса образца; (5) -трубка соединенная с датчиком спектрометра ЯМР; (6) шторка для управления светом.
Несмотря на несколько большую погрешность (-10%) по сравнению со струевой методикой имевшейся к тому времени в ряде зарубежных лабораторий, данный метод имеет и ряд преимуществ. Первое - меньшее время переноса (1-2 сек против 2-3 сек); второе - меньший расход образца (в струевой методике 80% раствора тратится вхолостую); и третье - вращение образца существенно повышает разрешающую способность и чувствительность метода. С использованием этой установки были измерены полевые зависимости ХПЯ в модельных реакциях фотовосстановления хинонов в присутствие доноров электрона и атома водорода [25-28]. Эта работа проводилась одновременно с развитием нового теоретического подхода к описанию ХПЯ в слабых МП - так называемого «полуклассического приближения» - и позволила описать основные закономерности формирования ХПЯ в слабых МП в многоядерных радикальных парах [25-26]. Параллельно Гришиным и Багрянской в лаборатории создавалась струевая установка, которая впоследствии была использована для наблюдения эффектов стимулированной поляризации ядер (СПЯ) [см., например, работу 29].
21
1.3.2. Полуклассическое описание ХПЯ в слабых магнитных полях в многоядерных
Использование полевых зависимостей ХПЯ в слабых МП для изучения проблемы взаимного влияния ядер с конечной целыо идентификации радикальных пар но виду полевой зависимости требует удобного метода расчета ХПЯ в реальных многоядерных системах. Мы остановились на широко известном полуклассическом методе расчета вероятности рекомбинации РП с большим числом магнитных ядер предложенном в 1978 году Шультеном и Волииесом, который позволяет существенно упростить процедуру расчета [30]. В рамках этого приближения ядерные магнитные моменты рассматриваются как классические векторы. Предполагается, что поле создаваемое всеми магнитными ядрами в месте нахождения неспаренного электрона радикала можно рассматривать, как внешнее поле. Это локальное поле СТВ складывается с приложенным внешним постоянным полем. Для большого числа магнитных ядер оправдано предположение о гаусовском распределении напряженности локальных магнитных полей Нь с дисперсией равной второму моменту СТС (сверхтонкая структура) спектра ЭПР соответствующего радикала.
где 1к - спин к-го ядра, Ак - константа СТВ.
Полуклассическое приближение успешно применяется для анализа влияния внешнего магнитного поля на химические реакции и магнитного изотопного эффекта [30-33]. Пуртовым и Салиховым было предложено применить полуклассическое приближение и для расчета интегрального эффекта ХПЯ в слабых магнитных полях в РП с большим числом магнитных ядер [34]. Проведенные нами модельные расчеты и сравнение их с экспериментальными полевыми зависимостями ХПЯ позволили выявить границы применимости полуклассического приближения для анализа реальных многоядерных радикальных пар [25-26]. Было показано, что форма полевой зависимости существенно зависит от соотношения констант СТВ исследуемого ядра, а также остальных ядер того же радикала и радикала-партнера. Общий вывод о применимости полуклассического приближения таков: метод применим для расчета ХПЯ на ядрах с превалирующими константами СТВ на выделенном радикале. При этом значение констант СТВ на радикале-партнере может быть любым.
радикальных парах.
(1.2)
к
22
1.4. Метод PYESR с временным разрешением для измерения кинетических параметров образования и гибели короткоживущих радикальных пар
В настоящей работе была реализована идея об использовании импульсной микроволновой накачки электронных переходов в РП для получения кинетической информации о скоростях образования и гибели радикальных пар в мицеллах. На основе стационарной методики PYESR, разработанной и реализованной М. Оказаки в Японии [35-36] был создан время-разрешениый импульсный вариант этого метода. Применение данной методики позволяет детектировать спектр ЭПР промежуточной радикальной пары по изменениям в выходе продукта реакции - долгоживущего спинового аддукта. Отработка методики осущесгвлялась на модельной реакции фотовосстановления антрахинона. Облучение образца осуществлялось в кварцевой проточной кювете с помощью YAG лазера (Spectra Physics, GCR 150/10, 355 nm, 10 Hz). Точная задержка между микроволновым и лазерным импульсом контролировалась с использованием фотодетсктора и цифрового осциллографа Ivvatsu DS 8631. Время устанавливалось с помощью компьютера, синхронизирующего работу генератора импульсов (Ivvatsu SY2820) и спектрометра ЭПР (Jeol RE IX). Для накопления достаточного количества спинового аддукта облучение образца проводилось в течение 20 секунд импульсами но 10 мДж. Выход спинового аддукта рос линейно со временем облучения. Во всех экспериментах использовалась SDS мицелла и водорастворимая спиновая ловушка 3,5-дибром-4-нитрозо-бензо-сульфонаг, синтезированная согласно [37].
1.5. Метод ЭПР со спиновыми ловушками как инструмент для измерения скоростей
радикальных реакций Метод ЭПР со спиновыми ловушками нашел широкое применение в химии, биологии и медицине [38-44]. Особый интерес для биологии и медицины представляют возможности этого метода для детектирования биологически важных активных кислородных частиц: гидроксильного радикала, псрекисиого радикала, аниона,
супероксида и синглетного кислорода. Эго связано,, прежде всего, с той ролью, которую играют активные свободные радикалы и синглетный кислород в развитии многих тяжелых заболеваний, включая рак, атеросклероз и процессы старения организма [45-47]. В настоящей работе метод ЭПР со спиновыми ловушками применен для измерения скоростей реакции каротииоидов со свободными радикалами. Основной задачей, которую мы попытались решить, было моделирование антиоксидантного действия каротииоидов и изучение действия различных факторов на их антиоксидантную активность [48-51]. Идея метода заключается в измерении выхода стабильных спиновых аддуктов радикалов со
23
спиновыми ловушками в присутствие каротиноидов. В наших экспериментах были использованы три широко распространенные ловушки: РВЫ (Л^-Гегг-ЬШу1-а-рЬепу1т1гопе), ОМРО (5,5кНте1Ьу1-ругго1те-Л-ох1с1е), и МЫР (2-те1Ьу1-2-т1гоьо-ргорапе).
В результате протекания двух конкурирующих процессов, а именно реакции радикала с каротиноидом и со спиновой ловушкой, выход спинового аддукта уменьшается в присутствие каротиноида (Рис. 1.6).
Магнитное поле, Гс
Рисунок 1.6. Спектры ЭПР аддукта РВЫ-ООН в отсутствие (вверху) и в присутствие кантаксантина в диметилсульфоксиде. [РВЫ] = 5 мМ, [РеС12] = 1 мМ, [Н202] = 0.5М.
В результате, константы скорости захвата (ксяг) радикала каротиноидами могут быть рассчитаны из экспериментальной зависимости выхода спинового аддукта от концентрации каротиноида с помощью формулы (1.3).
4, = ЫЩ + кЛСаг]
А к^Т)
Здесь кет - константа скорости захвата радикала спиновой ловушкой (БТ), Ао и А -значения интенсивности сигнала спинового аддукта в отсутствие и в присутствие
24
каротиноида. Значения констант скорости реакции спиновых ловушек с различными радикалами можно найти кчт в имеющейся базе кинетических данных [52].
Измерения проводились на ЭПР спектрометре Varian В-12 (X-band, 9.5 GHz). Для генерации перекисных свободных радикалов была применена известная процедура с использованием реакции Фентона (1.4) [53-54].
Fe2* + Н202 =5=^ Fe3+ + ‘ОН + ОН"
'OH + DMSO *СН3 + CH3(OH)SO
"СН3 + Н202 ‘ООН + СН4 (14)
Ион двухвалентного железа (в нашей работе использовалась соль FeCI2) реагирует с перекисью водорода с образованием активного гидроксильного радикала, который с диффузионной скоростью реагирует с ДМСО с образованием метильного радикала [55-57]. Реакция метильного радикала с перекисью водорода эффективна только при высоких концентрациях Н2О2, при низких же концентрациях вид спектра ЭПР существенно отличается (Рис. 1.7-1.8) [48].
3360 3380 3400 3420
магнитное поле, Гс
Рисунок 1.7. ЭПР спектры спиновых аддуктов РВЫ зарегистрированных в реакции Фентона при различных концентрациях Н2С>2 в ДМСО ([РеСЩ = 1 мМ).
25